抑制PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲性及增殖力的影響

張振國(guó)，賈麗燕，楊廷艦，袁義美*，劉 偉*

（1．濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261031；2．濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濰坊 261031）

膠質(zhì)瘤是最多見的一類腦腫瘤，呈侵襲性生長(zhǎng)，病情進(jìn)展常常累及周圍腦組織，所以單純依靠手術(shù)切除無法治愈，5年存活率約為25%～35%[1,2]，同時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞抵抗射線輻射能力強(qiáng)，所以放射療法對(duì)于患者的預(yù)后意義不大[3]。隨著在分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究深入，靶向治療膠質(zhì)瘤具有重大意義，能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行選擇性殺傷[4]。多種因子共同參與致使膠質(zhì)瘤具有生長(zhǎng)侵襲性，其中PI3K/Akt通路激活具有關(guān)鍵性作用[5,6]，其可以參與細(xì)胞下游信號(hào)的激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖和代謝等[7]，因此通過研發(fā)特異性分子抑制劑對(duì)治療膠質(zhì)瘤意義深遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)以LY294002抑制PI3K/Akt通路活性，探究膠質(zhì)瘤侵襲性及增殖力的變化，現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)信息報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

（1）解凍：購(gòu)自上海中科院生物學(xué)細(xì)胞庫(kù)的膠質(zhì)瘤HS683細(xì)胞1瓶（1×106cells/瓶），在37℃的溫水中快速將其溶解；（2）脫壁：適量預(yù)溫（37℃）的PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞3次，1 min/次；（3）消化：加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，在二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）內(nèi)消化2分鐘；（4）終止消化：倒置顯微鏡下觀察可見細(xì)胞形態(tài)收縮變圓并脫落至瓶底，加入6 ml DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）立即終止消化；（5）細(xì)胞懸液：無菌吸管由下向上反復(fù)輕輕吹打，使其分散離團(tuán)制成單個(gè)細(xì)胞懸液；（6）轉(zhuǎn)移細(xì)胞至EP管中調(diào)整密度為104/200 μl，并加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色。

1.2 方法

1.2.1 MTT法

（1）微量移液器接種200 μl細(xì)胞懸液至96孔細(xì)胞板，培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中孵育24小時(shí)；（2）把EP管做好標(biāo)記并加入適量的無血清培養(yǎng)基，從高到低稀釋藥物濃度，分別向管中加入等量濃度為10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L的LY294002，以及濃度為2.5 ug/ml的順鉑，充分混勻，空白對(duì)照組不進(jìn)行藥物處理；（3）以每種藥物、不同濃度重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，分別向細(xì)胞板孔中加入200 μl無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)；（4）細(xì)胞孔內(nèi)加入20 ml濃度為5 mg/ml的MTT溶液（避光），作用4小時(shí)，棄去上清液并加入150 μl的DMSO溶液，藍(lán)色結(jié)晶溶解后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

（1）將冰存的Matrigel置于-4℃的冰上過夜，用冰預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按照1:6稀釋Matrigel至濃度為300 ul/ml，取100 ul稀釋的Matrigel加入上室，均勻涂抹在孔徑為8 um的碳酸酯膜表面，室溫放置3小時(shí)，使其聚合成凝膠；（2）向上室加入100 ul細(xì)胞懸液，并分別加入100 μl含有不同藥物、不同濃度的培養(yǎng)基，下室加入400 ul含趨化因子的無血清培養(yǎng)基；（3）放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，無菌棉簽拭去上室碳酸酯膜表面殘存的細(xì)胞，PBS緩沖液潤(rùn)洗2次，1min/次；（4）3%甲醛溶液固定10 min，臺(tái)盼藍(lán)染色3分鐘，低倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)隨機(jī)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

與空白對(duì)照組比較，DDP對(duì)照組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性減弱（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1）。

表1 兩組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.3 三組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

與空白對(duì)照組、DDP對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組（LY294002 10 umol/L）膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.4 三組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

與實(shí)驗(yàn)組（LY294002 10 umol/L）比較，實(shí)驗(yàn)組（LY294002 20 umol/L、40 umol/L）膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性減弱，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.5 兩組細(xì)胞相對(duì)增殖率比

與空白對(duì)照組、DDP對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組（LY294002 10 μmol/L）細(xì)胞的相對(duì)增殖率明顯降低，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的LY294002可以使細(xì)胞相對(duì)增殖率從86.4%降至58.3%、37.9%、20.0%。見圖1。

圖1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相對(duì)增殖率比較

3 討 論

膠質(zhì)瘤是惡性程度很高的原發(fā)性腦腫瘤，在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率約占36%～61%[8]。同時(shí)腫瘤的臨床表現(xiàn)形式也是多種多樣，其中以占位效應(yīng)最為突出，系于不斷增大的瘤體以及水腫程度加劇的周圍腦組織對(duì)正常腦組織的壓迫所致，顱內(nèi)壓增高一般會(huì)有三種常見的癥狀，諸如：頭痛（最多見）、嘔吐（噴射性）、視物不清等[9]。除此之外，還有部分惡性程度很高的膠質(zhì)瘤往往發(fā)生發(fā)展迅速，可在短時(shí)間內(nèi)壓迫正常腦組織并使之移位，有發(fā)生腦疝的風(fēng)險(xiǎn)[10]。盡管目前針對(duì)膠質(zhì)瘤治療的手術(shù)及化療藥物都不斷得到改進(jìn)，但療效一般，其中位生存期只有1年左右[11]?；颊呓邮艹Ｒ?guī)手術(shù)治療后容易再次復(fù)發(fā)的一個(gè)重要原因就是膠質(zhì)瘤不斷侵襲轉(zhuǎn)染周圍正常腦組織[12]，同時(shí)射線只能不同程度的殺死惡變細(xì)胞，所以療效不理想。

隨著在分子生物學(xué)領(lǐng)域不斷取得新的突破性進(jìn)展，已有研究表明，激活的PI3K/Akt信號(hào)通路具有很強(qiáng)的刺激腫瘤生長(zhǎng)侵襲的作用。膠質(zhì)瘤發(fā)生演變的早期階段，經(jīng)歷的主要分子事件即為表皮因子生長(zhǎng)受體（EGFR）由于受到多種因素誘導(dǎo)發(fā)生的基因突變以及蛋白的過度表達(dá)[13]。EGFR與其相應(yīng)的胞內(nèi)或膜上配體結(jié)合可以激活自身，或由于體內(nèi)EGFR受環(huán)境影響發(fā)生基因突變從而導(dǎo)致其處于持續(xù)的活化不衰減狀態(tài)，這樣會(huì)把酪氨酸不斷活化使之在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表現(xiàn)為磷酸化形式[14]。EGFR可以通過多種方式調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)過度增殖[15]，最關(guān)鍵的途徑就是通過PI3K增加此信號(hào)通路的活性。PI3K作為細(xì)胞膜上的第二信使，可以調(diào)節(jié)多種活性蛋白的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、代謝等的生理學(xué)作用，這極大地提高了膠質(zhì)瘤的侵襲性及增殖力[16]，因此通過特異性分子抑制劑減弱PI3K/Akt信號(hào)通路能夠?yàn)閺V大膠質(zhì)瘤患者帶來一絲曙光，為臨床醫(yī)師提供更有效的診療方案[17]。

已有研究證實(shí)，肺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤患者通過應(yīng)用LY294002可以明顯提高化療效果，對(duì)改善患者預(yù)后有很大的幫助，但在膠質(zhì)瘤治療效果方面的報(bào)道仍很罕見，我們的數(shù)據(jù)表明抑制PI3K/Akt通路在降低腫瘤侵襲能力方面有著積極的作用；有研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物順鉑聯(lián)合LY294002應(yīng)用組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及增殖力較單純使用順鉑組減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，抑制濃度俞大抑制效應(yīng)愈顯著，但結(jié)果尚差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；李洋等人研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組、DMSO組相比，經(jīng)過LY294002處理的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖力明顯降低（10 μmol/L LY294002組相對(duì)存活率為55%，20 μmol/L組為30%），實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明，LY294002組膠質(zhì)瘤的侵襲能力明顯降低（52±4）%，差異顯著。該實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，DDP組相較于空白組細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲性也有不同程度的減弱，但結(jié)果差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與空白對(duì)照組和DDP組相比，實(shí)驗(yàn)組（LY294002 10 μmol/L）細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲性受到非常大程度抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)同之前報(bào)道過的相關(guān)實(shí)驗(yàn)相比優(yōu)點(diǎn)在于，研究同樣也表明，隨著抑制劑濃度的增大（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LY294002)，細(xì)胞的侵襲性以及增殖力會(huì)更加減弱，但是，抑制劑的不同濃度對(duì)膠質(zhì)瘤的抑制效應(yīng)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍需進(jìn)行下一步探討研究。

隨著在醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域不斷取得新的進(jìn)展，未來科研的重點(diǎn)應(yīng)放在加快針對(duì)此信號(hào)通路抑制藥物的研發(fā)，這些分子靶向性藥物有望在膠質(zhì)瘤的治療中發(fā)揮更有效的作用，以期取得令人更滿意的臨床效果。

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