不同來源革蘭陰性菌armA基因分布與氨基糖苷類抗生素耐藥性

龔 林, 李 娟, 袁 敏, 陳 霞, 盧金星, 梁建生, 羅成旺

(1 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206；2 武漢市疾病預(yù)防控制中心，湖北 武漢 430015)

近年來，越來越多的菌株產(chǎn)生了對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥性，使臨床上常用的氨基糖苷類抗生素的臨床抗感染效果日益減弱。 16S rRNA甲基化酶的產(chǎn)生是氨基糖苷類抗生素耐藥的重要機(jī)制，該類酶的產(chǎn)生阻斷了氨基糖苷類藥物與作用靶點(diǎn)的接合，介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)幾乎所有的氨基糖苷類藥物高水平耐藥[1]。

編碼該酶的基因包括npmA、armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG和rmtH[2]，其中armA基因是分布最廣泛的16S rRNA甲基化酶基因[3]。它于2003年在法國一株肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)[4]，隨后的幾年里，西班牙、日本、保加利亞、韓國、臺(tái)灣地區(qū)等均有報(bào)道[5-10]。且該基因也發(fā)現(xiàn)于多種革蘭陰性菌中，包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、黏質(zhì)沙雷菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌等[6-10]，在世界各地呈現(xiàn)出散發(fā)或暴發(fā)的趨勢(shì)。armA基因由774個(gè)堿基組成，其G+C含量為30.4%，比其他16s rRNA甲基化酶基因都低，并且armA基因編碼的氨基酸與其他16s rRNA甲基化酶氨基酸的同源性均低于30%[11]。該編碼基因通常位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或I 類整合子[11]上，通過其高度可移動(dòng)性，可在菌株間廣泛轉(zhuǎn)移和傳播。目前，耐氨基糖苷類抗生素的armA基因在不同地區(qū)的革蘭陰性菌中分布相差懸殊[12-15]。因此，有必要對(duì)其進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，以闡明armA在氨基糖苷類抗生素耐藥中的作用和地位。本研究對(duì)不同來源的革蘭陰性菌進(jìn)行了氨基糖苷類耐藥性分析和armA基因檢測(cè)，以了解該基因在本地區(qū)的流行特征以及基因型與藥敏表型的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2011年2月—2014年11月不同來源的革蘭陰性菌953株，其中846株菌株分離自國內(nèi)3所三甲醫(yī)院住院患者送檢的痰、分泌物、尿、血、腦脊液等非重復(fù)標(biāo)本；107株菌株來自于山東某養(yǎng)雞場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的種雞體表、種雞內(nèi)臟、養(yǎng)殖人員體表、屠宰人員體表、屠宰水、屠宰雞等標(biāo)本。

1.2 儀器和試劑 熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)、VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)、熒光定量PCR反應(yīng)試劑(瑞士Roche公司)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 所有菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2016年版標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.4armA基因的檢測(cè) 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取革蘭陰性菌基因組。熒光定量PCR的方法檢測(cè)armA基因，引物及探針如下：armA-F:5’-TCAAAAACCTATACTTTATCGTCGTCTT-3’，armA-R:5’-TATTTTAGATTTTGGTTGTGGCTTCA-3’，TaqMan探針：FAM-AACTTCCCAATAATGCTAC-MGB，擴(kuò)增片段長度為162bp[16]。擴(kuò)增反應(yīng)體系參考相關(guān)文獻(xiàn)[16]。LightCycler○R480熒光定量PCR擴(kuò)增程序如下：(1)預(yù)變性：95℃ 3 min；(2) 擴(kuò)增: 95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 1 s，40個(gè)循環(huán)；(3)冷卻：40℃ 10 s。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 本研究共收集953株革蘭陰性菌，其中846株為臨床來源菌株，107株為養(yǎng)殖場(chǎng)來源菌株。臨床來源菌株種屬分布為：克雷伯菌屬385株，不動(dòng)桿菌屬176株，埃希菌屬91株，假單胞菌屬66株，腸桿菌屬48株，沙雷菌屬27株，其他種屬53株；養(yǎng)殖場(chǎng)來源均為克雷伯菌屬菌株。

2.2 對(duì)氨基糖苷類藥敏結(jié)果 除沙雷菌屬和不動(dòng)桿菌屬外，其他菌屬對(duì)阿米卡星藥物敏感性的MIC50均≤8 μg /mL；不動(dòng)桿菌屬的耐藥率最高，為86.4%，埃希菌屬的耐藥率最低，僅為7.7%。菌株對(duì)慶大霉素藥物敏感性的MIC50均≥16 μg/mL；各菌屬對(duì)慶大霉素耐藥率均在54%以上，其中耐藥率最高的為不動(dòng)桿菌屬，達(dá)89.8%。見表1。

2.3armA基因攜帶情況 本研究收集的菌株armA陽性率為26.9%(256/953)，其中armA陽性率最高的是不動(dòng)桿菌屬，高達(dá)66.5%；埃希菌屬和假單胞菌屬armA陽性率較低，僅為3.3%和3.0%。見表1。

表1 不同種屬菌株對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥情況及armA基因檢測(cè)結(jié)果

2.4armA基因攜帶與藥物敏感性的關(guān)系 256株armA陽性菌株對(duì)阿米卡星和慶大霉素耐藥率高達(dá)95.7%和98.4%，極少數(shù)armA陽性菌株對(duì)阿米卡星和慶大霉素敏感，比率分別為4.3%和1.6%； 697株armA陰性菌株中仍有部分菌株對(duì)阿米卡星和慶大霉素耐藥，比率分別為14.6%和49.6%，見表2。對(duì)兩表中基因與藥物作關(guān)聯(lián)性分析，阿米卡星、慶大霉素關(guān)聯(lián)系數(shù)(r)分別為0.598、0.408，均P<0.001，攜帶armA基因的菌株與兩種氨基糖苷類抗生素的藥敏表型均存在關(guān)聯(lián)，且與阿米卡星藥敏表型的關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)。

2.5 對(duì)不同氨基糖苷類藥物耐藥率的比較 攜帶armA基因的革蘭陰性菌對(duì)慶大霉素與阿米卡星耐藥率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；未攜帶armA基因的革蘭陰性菌中，臨床來源的腸桿菌屬、埃希菌屬、克雷伯菌屬、假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬對(duì)慶大霉素的耐藥率均高于阿米卡星，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表2953株革蘭陰性菌armA基因攜帶及其對(duì)阿米卡星、慶大霉素的耐藥情況(株)

Table2Carrying ofarmA gene, as well as amikacin and gentamicin resistance of 953 gram-negative bacterial strains (No. of isolates)

armA攜帶株數(shù)阿米卡星耐藥非耐藥慶大霉素耐藥非耐藥陽性256245112524陰性697102595346351合計(jì)953347606598355

表3 不同菌屬armA基因攜帶及其對(duì)氨基糖苷類耐藥情況(株)

*：Fisher’s確切概率法

2.6 不同來源克雷伯菌屬armA基因攜帶與耐藥性的比較 養(yǎng)殖場(chǎng)來源克雷伯菌屬對(duì)阿米卡星、慶大霉素耐藥率和armA基因攜帶率分別為74.8%、79.4%和65.4%，均高于臨床來源菌株(χ2值分別為166.59、32.79、158.26，均P<0.05)。見表4。

表4不同來源克雷伯菌屬對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥及armA基因檢出情況[株(%)]

Table4Aminoglycoside resistance and detection results ofarmA gene inKlebsiellaspp. strains from different sources (No. of isolates[%])

來源菌株數(shù)阿米卡星耐藥慶大霉素耐藥armA基因陽性臨床來源38549(12．7)186(48．3)35(9．1)養(yǎng)殖場(chǎng)來源10780(74．8)85(79．4)70(65．4)

3 討論

氨基糖苷類抗生素是臨床抗感染治療的重要藥物。了解細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥現(xiàn)狀及其耐藥性發(fā)展趨勢(shì)，將為控制耐藥菌的傳播提供重要信息[17]。由于armA基因在國內(nèi)外各地區(qū)的革蘭陰性菌中分布相差懸殊，本研究較大規(guī)模的調(diào)查了國內(nèi)部分地區(qū)的臨床來源和養(yǎng)殖場(chǎng)來源的革蘭陰性菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的藥物敏感性和armA的攜帶情況，為了解該地區(qū)細(xì)菌中armA的分布提供線索，明確該地區(qū)armA在氨基糖苷類抗生素耐藥中的作用。但本試驗(yàn)仍存在部分局限性：菌株來源非隨機(jī)樣本，不能完全反映研究地區(qū)的氨基糖苷類耐藥和基因攜帶水平。

本研究收集的953株革蘭陰性菌對(duì)阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別為36.4%和62.7%，與吳瓊等[18]報(bào)道的基本一致。其中不動(dòng)桿菌屬對(duì)阿米卡星和慶大霉素的耐藥率已分別達(dá)到86.4%和89.8%，提示氨基糖苷類抗生素已很難有效地治療由不動(dòng)桿菌屬引起的感染。其次克雷伯菌屬、腸桿菌屬和沙雷菌屬對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥性也日益嚴(yán)重。如果耐藥菌的產(chǎn)生和傳播不能得到有效控制，將進(jìn)一步削弱氨基糖苷類抗生素的臨床使用價(jià)值。

本研究菌株中armA基因陽性率為26.9%。潘韻峰等[19]在國內(nèi)多個(gè)省市各醫(yī)院調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌中armA基因陽性率達(dá)47.7%，本研究的調(diào)查結(jié)果為66.5%，提示該基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中存在進(jìn)一步擴(kuò)散的可能。此外，armA陽性率在沙雷菌屬、腸桿菌屬中也高達(dá)51.9%和27.1%，提示armA 基因的傳播可能已突破菌屬界限，實(shí)現(xiàn)了種屬間的水平傳播。

本次研究分析了攜帶armA基因菌株的藥物敏感性，其對(duì)阿米卡星和慶大霉素耐藥率高達(dá)95.7%和98.4%。由此可見，armA基因的攜帶與氨基糖苷類抗生素耐藥表型具有很高的一致性，此結(jié)果也與armA的耐藥機(jī)制相吻合：修飾氨基糖苷類抗生素的作用靶點(diǎn)，從而導(dǎo)致細(xì)菌幾乎對(duì)所有氨基糖苷類抗生素高水平耐藥。本研究中發(fā)現(xiàn)部分菌株雖然耐藥，但未檢出armA基因，提示還存在其他氨基糖苷類耐藥機(jī)制。也有極少數(shù)菌株雖然基因檢測(cè)陽性，但表現(xiàn)為敏感，armA基因是否發(fā)生了突變或者是否其轉(zhuǎn)錄、表達(dá)受到了抑制尚待進(jìn)一步驗(yàn)證[20]。養(yǎng)殖場(chǎng)來源克雷伯菌屬菌株的armA基因攜帶率高于臨床來源，提示armA基因在養(yǎng)殖場(chǎng)來源菌株中的流行度可能更廣。相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物養(yǎng)殖中對(duì)抗菌藥物使用的監(jiān)管，密切監(jiān)測(cè)動(dòng)物源菌的耐藥情況以及流行趨勢(shì)，采用各種防治手段進(jìn)行控制，以減少耐藥菌的傳播[20]。

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