樹干注藥對馬尾松針葉幾種生理指標和保護酶活性的影響

楊鼎超，郝菲菲，張 揚，張林平，欒豐剛，曾菊平

（江西農(nóng)業(yè)大學 林學院， 江西 南昌 330045）

樹干注藥技術是將藥劑直接注入樹干內(nèi)[1]，藥劑在樹體內(nèi)具有較長的殘留期，相對于噴霧法和煙霧法，其對林木蛀干、枝梢等害蟲有良好的防治效果，且不易污染環(huán)境、殺傷天敵等，因此，樹干注藥技術在林木害蟲防治中得到極大應用[2-4]。唐光輝等研究表明有內(nèi)吸性的藥劑在樹體內(nèi)的活性不如無內(nèi)吸作用的藥劑[5]。這表明注干藥劑不等同于內(nèi)吸性藥劑，藥劑的防效取決于助劑類型。然而，藥劑在樹體內(nèi)與植物密切接觸，會對植物產(chǎn)生直接的影響[6]，故對樹干注藥開展安全性研究具有重要意義。

氯氟氰蟲酰胺是浙江省化工研究院有限公司自主開發(fā)的一類高效、作用機制獨特的鄰苯二甲酰胺類新型殺蟲劑[7]，與傳統(tǒng)的殺蟲劑無交互抗性，對哺乳動物較為安全，已廣泛用于鱗翅目害蟲的防治[8-11]。目前，國內(nèi)外有關氯氟氰蟲酰胺在林木中輸導及其安全性評價的研究尚未見報道，而氯氟氰蟲酰胺在林間對松材線蟲病Bursaphelenchus xylophilus表現(xiàn)出良好的防效[12]。為此，采用樹干注藥技術將氯氟氰蟲酰胺液體制劑注入馬尾松Pinus massoniana樹干內(nèi)，分析其對馬尾松針葉葉綠素含量、可溶性糖含量、丙二醛、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的影響，探索其對馬尾松生理代謝的作用機制，為樹干注藥技術對馬尾松的安全性評價和松材線蟲病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

4.8 %氯氟氰蟲酰胺乳油，4.5%甲維鹽乳油由江西大農(nóng)化工有限公司提供，分別裝至50 mL容量注射瓶內(nèi)。丙酮、丙二醛試劑盒、超氧岐化酶試劑盒、苯丙氨酸解氨酶試劑盒、蒽酮、乙酸乙酯等藥劑和試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

供試樹木馬尾松，于江西農(nóng)業(yè)大學南昌商學院校園內(nèi)選擇樹齡8 a，樹高5 ～ 6 m，胸徑8 cm左右，生長良好的馬尾松45棵。

1.2 樹干注藥及采樣

于2015年3月25日采用注干施藥技術，用便攜式電鉆傾斜45°在馬尾松樹干距地面1.3 m處打1個4 ～ 5 cm深的孔，每棵樹分別注入4.8%氯氟氰蟲酰胺乳油或4.5%甲維鹽乳油1瓶（50 mL），每個處理重復3次（每個重復5株，即2種藥劑各注15棵），以不注藥的等量馬尾松為對照（CK）。在注藥后的1 d，4 d，8 d，12 d，16 d分別在處理樹冠中部的東、西、南、北四個方向進行針葉取樣，每個方向每次取樣量不少于30 g，將針葉用自來水沖洗干凈擦干后，密封于真空封口袋中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生理指標測定

將待測的馬尾松針葉于105℃下殺青，80℃下烘干，稱重后研磨粉碎。葉綠素含量的測定采用丙酮法進行，具體方法參考張憲政[13]，并略有改動。可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法進行，具體方法參考李合生等[14]，并略有改動；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定[15]。

1.4 保護酶活性測定

酶粗提液的制備具體方法參照唐光輝等[16]，并稍作改動。苯丙氨酸解氨酶（PAL）通過測定D290值，以D290變化0.01為1個酶活力單位[17]；超氧化物歧化酶（SOD）采用黃氮藍四唑法（NBT）測定[14]，每分鐘內(nèi)抑制光氧化還原NBT 50%為1個酶活性單位（U），酶活性為每克鮮樣的U數(shù)（U·g-1）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，Duncan法進行差異顯著性分析，作圖采用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹干注藥對馬尾松針葉葉綠素的影響

由圖1可知，處理4 d時2種藥劑均可導致總?cè)~綠素，葉綠素a，b含量下降，其中氯氟氰蟲酰胺處理葉綠素a含量降低最多（10.3%），但處理8 d后2種藥劑又可引起總?cè)~綠素，葉綠素a，b含量呈不同程度升高，仍以氯氟氰蟲酰胺的刺激作用較為顯著，16 d時葉綠素a含量較對照提高了10.5%。因此，樹干注藥對馬尾松針葉內(nèi)總?cè)~綠素含量沒有顯著影響，但對葉綠素a含量有顯著影響（表1）。

圖1 樹干注藥對馬尾松針葉葉綠素含量的影響Figure 1 Trunk injection of 2 pesticides on the chlorophyll content in leaves of P. massoniana

表1 樹干注藥后馬尾松針葉葉綠素方差分析Table 1 ANOVA on chlorophyll content in leaves of P. massoniana after trunk injection

2.2 樹干注藥對可溶性總糖含量的影響

由圖2可知，2種藥劑處理對馬尾松針葉中可溶性總糖含量有不同程度的影響。氯氟氰蟲酰胺處理8 d時可溶性總糖含量最低，比對照降低15%，12 d達到最高；甲維鹽注藥4 d時可溶性總糖含量最高，12 d時可溶性總糖含量最低，比對照降低35%。由方差分析可知，不同藥劑樹干注射對馬尾松針葉內(nèi)總可溶性糖含量沒有顯著影響（表2）。

表2 樹干注藥后馬尾松針葉可溶性糖方差分析Table 2 ANOVA on soluble sugar content in leaves of P. massoniana after trunk injection

圖2 樹干注藥對針葉中可溶性總糖含量的影響Figure 2 Effect trunk injection of pesticides on total soluble sugar content of in leaves of P. massoniana

圖3 樹干注藥后馬尾松針葉內(nèi)MDA含量的變化Figure 3 Effect trunk injection of pesticides on MDA content in leaves of P. massoniana

2.3 樹干注藥對馬尾松針葉中MDA含量的影響

由圖3可知，樹干注藥后MDA含量經(jīng)歷上升-下降的變化。2種藥劑處理4 d時，MDA含量均達到最高，與對照相比均上升了42%；藥后16 d時各藥劑處理組的MDA含量均已接近對照水平。由表3可知，不同藥劑樹干注射對馬尾松針葉內(nèi)MDA含量有顯著影響。

表3 樹干注藥后馬尾松針葉丙二醛方差分析Table 3 Variance analysis of MDA content of P. massoniana by trunk injection

2.4 樹干注藥對馬尾松針葉內(nèi)SOD活性的影響

由表4可知，不同藥劑樹干注射對馬尾松針葉內(nèi)SOD酶活性有顯著影響。由圖4可知，樹干注藥后SOD活性呈上升-下降-上升-下降的波動變化。氯氟氰蟲酰胺處理對SOD活性影響較顯著，注藥后4 d酶活性達到最高，與對照相比上升了39.5%；而甲維鹽處理4 d后酶活性也達到最高，與對照相比上升了31.7%，而處理8 d時酶活性達到最低。藥后16 d 2種藥劑處理SOD活性均逐漸接近對照水平。

表4 樹干注藥后馬尾松針葉SOD酶活性方差分析Table 4 ANOVA on SOD avtivity in leaves of P. massoniana after trunk injection

圖4 樹干注藥后馬尾松針葉內(nèi)SOD酶活性的變化Figure 4 Effect of trunk injection of pesticides on SOD activity in leaves of P. massoniana

圖5 樹干注藥后馬尾松針葉內(nèi)PAL酶活性的變化Figure 5 Effect of trunk injection of pesticides on PAL activity in leaves of P. massoniana

2.5 樹干注藥對馬尾松針葉中苯丙氨酸解氨酶PAL活性的影響

樹干注藥后PAL活性經(jīng)歷上升-下降的變化，且氯氟氰蟲酰胺對PAL酶活性影響顯著（圖5，表5）。2種藥劑處理8 d后酶活性達到最高，其中氯氟氰蟲酰胺處理與對照相比，酶活性上升了40.7%，之后迅速下降；而甲維鹽處理后8 d，與對照相比酶活性上升了22.8%，隨后緩慢下降。

表5 樹干注藥后馬尾松針葉PAL酶活性方差分析Table 5 ANOVA on PAL activity in leaves of P. massoniana after trunk injection

3 結(jié)論與討論

2種注干藥劑經(jīng)樹干注射后對馬尾松針葉內(nèi)葉綠素、可溶性總糖、MDA含量和SOD、PAL酶活性均可產(chǎn)生一定的影響，進而可能會對馬尾松的正常生理代謝產(chǎn)生一定的影響。2種注干藥劑對葉綠素、可溶性總糖含量的影響主要表現(xiàn)為先抑制后增高，而對MDA含量的影響主要表現(xiàn)為先增高后降低。藥劑處理后SOD、PAL活性均呈現(xiàn)出先上升、后抑制的波動變化，其中藥劑氯氟氰蟲酰胺對SOD、PAL活性影響較為明顯。

農(nóng)藥使用后對非靶標植物生長[18]和生理代謝的影響日益受到研究人員的關注，垂柳Salix babylonicaLinn.樹干注藥后，導致其葉片葉綠素和可溶性蛋白含量下降，垂柳的正常生理代謝受到抑制[19]；桃Amygdalus persicaL.采用樹干注藥和葉面噴霧 2種施藥方法，結(jié)果葉面噴霧造成葉綠素含量下降、凈光合速率降低，而樹干注藥則增加葉綠素含量并提高凈光合速率[20]，上述研究結(jié)果表明，農(nóng)藥可以抑制植物的生長和代謝。本研究結(jié)果表明，氯氟氰蟲酰胺和甲維鹽樹干注藥后可在短期內(nèi)使馬尾松針葉葉綠素、可溶性糖含量降低，表明該2種藥劑對葉綠素、可溶性糖含量具有抑制作用，隨著處理時間的延長，針葉抵制藥劑富集作用后逐漸適應，葉綠素、可溶性糖含量又可恢復至對照水平，而 MDA含量先增加后減少，表明樹干注藥后馬尾松的防御系統(tǒng)首先產(chǎn)生應激反應，生產(chǎn)大量MDA，隨著時間的推移，藥劑對馬尾松的脅迫逐漸減弱，馬尾松樹體可通過自身的調(diào)節(jié)作用恢復正常的生理生化代謝水平。同時，氯氟氰蟲酰胺樹干注射不同程度地提高馬尾松針葉內(nèi)SOD，PAL的活性，這與唐光輝等[16]研究結(jié)果相一致。此外，脯氨酸（與細胞壁的形成有關）含量變化和其他生理指標測定在后續(xù)的試驗中進行完善，同時將測定氯氟氰蟲酰胺注干后土壤相關酶變化等，以便更好評價氯氟氰蟲酰胺注干后對馬尾松生長和代謝的影響。

樹干注藥的藥劑使用不當會對樹體產(chǎn)生藥害，周家華等[21]進行柑橘Citrus reticulataBlanco保果試驗時，大劑量使用“噴施靈”增加了柑橘的落果量；陳運全等[22]使用高濃度營養(yǎng)液注射柑橘枝干后導致受害枝葉全部脫落。本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，用30 mL氯氟氰蟲酰胺和甲維鹽液體制劑注射3 ～ 4年生馬尾松苗時，導致部分松苗死亡，而注射5年生以上馬尾松苗時，則未出現(xiàn)松苗死亡現(xiàn)象，表明藥劑不論注干還是葉面噴施時使用劑量要適量。有關氯氟氰蟲酰胺樹干注射的有效劑量，藥劑在馬尾松樹體內(nèi)的殘留時間以及馬尾松樹體應對氯氟氰蟲酰胺脅迫和自我調(diào)節(jié)恢復機制，有待于進一步深入研究。

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