樟子松2種塊菌屬外生菌根形態(tài)描述和分子鑒定

張文泉，羅國濤，閆 偉

（1. 凱里學(xué)院，貴州 凱里，556011；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

塊菌（Truffles）是一類地下真菌，其許多種類具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是大型真菌中最為珍稀名貴的食用真菌之一，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及多種易被人體吸收的氨基酸和無機(jī)鹽，如黑孢塊菌Tuber melanosporum和意大利白塊菌T. magnatum，與魚子醬、鵝肝醬同被稱為三大珍品。國外對(duì)塊菌的研究有近200 a歷史，1985我國的劉波首次對(duì)太原塊菌T. taiyuanense進(jìn)行報(bào)道[1]。有人對(duì)我國的塊菌資源開展了大量的研究。至今已報(bào)道的中國塊菌有近30種，主要分布于我國的國塊菌主要分布在四川和云南，此外西藏、新疆、山西、遼寧、吉林、福建、湖南、湖北、甘肅、北京、河北、臺(tái)灣均有分布，主要集中在100° ～ 105° E，25° ～ 30° N這一條帶上[2-4]。

樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica適應(yīng)性強(qiáng)，抗寒、抗旱、耐貧瘠，防風(fēng)固沙作用顯著，在我國北方地區(qū)廣泛分布。由于樟子松適應(yīng)性強(qiáng)而且較速生，目前是我國北方地區(qū)主要的造林樹種之一[5-6]。對(duì)內(nèi)蒙古樟子松外生菌根真菌多樣性的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)[7-8]，與樟子松共生的外生菌根真菌中有典型的Tuber屬真菌2種塊菌，對(duì)其類型進(jìn)行了描述和分子鑒定，為樟子松優(yōu)良鄉(xiāng)土菌種篩選提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)又豐富了我國北方地區(qū)塊菌菌根真菌資源多樣性。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

采集地點(diǎn)為內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾大興安嶺林場(chǎng)莫爾道嘎林業(yè)站及紅花爾基林業(yè)站、烏蘭察布市涼城林場(chǎng)、赤峰市黃崗梁林場(chǎng)、鄂爾多斯市伊金霍洛旗林場(chǎng)、遼寧章古臺(tái)林場(chǎng)，每個(gè)林場(chǎng)作為一個(gè)采集地。在以上采集地的樟子松天然林或人工純林群落中距樟子松主干0.5 ～ 1.0 m范圍內(nèi)，取長×寬×深為20 cm×20 cm×30 cm 帶根土樣，每一采集地隨機(jī)采集9個(gè)樣品，每一樣品的采集地間隔10 m以上，采集時(shí)間分別為2014，2015年的5月與10月，每個(gè)采集地都采樣2次遼東塊菌。所采集的樣品分別采用密封塑料袋分裝，樣品取回后與密封塑料袋一起置于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 樣品處理

樣品取回后盡早取樣，最遲5 d內(nèi)處理完畢，將土樣浸泡于水中2 ～ 3 h后倒入土篩中流水沖洗，將洗凈后的根樣剪成小段，置于培養(yǎng)皿中，采用體視顯微鏡觀察，挑選出有菌根的根段。

1. 3 形態(tài)分類

根據(jù)菌根表面特征對(duì)菌根進(jìn)行初步分類，分類的依據(jù)為顏色、外延菌絲、有無根狀菌索、菌核、囊狀體等特征，并采用Olympus SZX10體視顯微鏡拍照，記錄其顯著特征。

對(duì)初步分類后的每一菌根類別的菌套進(jìn)行剝離、制片。在Olympus BX41光學(xué)顯微鏡下對(duì)每一菌根類別的菌套特征、外延菌絲特征、菌索特征進(jìn)行觀察并詳細(xì)記錄。

結(jié)合菌根的外部形態(tài)特征和菌套的解剖結(jié)構(gòu)特征，將菌根分成不同的形態(tài)類型，將每一種形態(tài)類型的菌根選取新鮮、幼嫩、純凈的同一分支系統(tǒng)菌根一部分采用1/2 FAA固定液，用于形態(tài)觀察，另一部分置于CTAB緩沖液中保存，用于分子生物學(xué)鑒定。菌根系統(tǒng)形態(tài)分類和描述參照Agerer[9-10]。

1.4 分子鑒定

1.4.1 DNA的提取 采用 CTAB法[7]提取DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系（50 u1）中：Template 2 ul；ITS1s，ITS4引物各2 ul，2×Master Mixture 25 ul，不足部分用ddH2O補(bǔ)足，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Masetercycler PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃平展10 min，PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序交由生工生物工程公司。序列的編輯用Bioedit完成。在GenBank（NCBI）將編輯的菌根rDNA ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)序列的相似度來確定菌根真菌的分類關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征

通過外生菌根的形態(tài)比較觀察，發(fā)現(xiàn)樟子松的外生菌根中有2個(gè)類型的形態(tài)結(jié)構(gòu)與塊菌屬相似，對(duì)這2個(gè)塊菌屬的樟子松外生菌根形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征描述如下。

類型1。

菌根系統(tǒng)為單軸或羽狀分支，分支1 ～ 2級(jí)，親水。未分支的末端細(xì)尖狀，末端未見明顯膨大，長1 ～ 2 mm，直徑0.7 mm，幼時(shí)為淺褐色，老時(shí)顏色略有加深，為黃褐色。未分支末端有少量稀疏的外延菌絲，外延菌絲較短，無根狀菌索，無囊狀體，無菌核（圖1A，圖1B）。

外層菌套為擬薄壁組織，菌套類型為M型[9-10]，菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁較薄，菌絲有隔，無鎖狀聯(lián)合，菌絲互相連接呈表皮細(xì)胞狀，菌絲表面較光滑，彎曲分支形成網(wǎng)狀。內(nèi)層菌套與外層菌套一致（圖1C，圖1D）。菌套7 ～ 8 μm厚，由橢圓形細(xì)胞規(guī)則排列組成，哈蒂氏網(wǎng)伸入皮層細(xì)胞2 ～ 3層（圖1E，圖1F）。

圖1 類型1菌根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)圖Figure 1 External morphology and anatomical features of type 1

圖2 類型2菌根外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)圖Figure 2 External morphology and anatomical features of type 2

類型2。

菌根系統(tǒng)為二叉分支，分支1 ～ 2級(jí)，親水。菌根的末端圓棒狀，末端可見明顯膨大，長1.0 ～ 1.5 mm，直徑為1 mm，幼嫩時(shí)為淺黃色，老時(shí)為黃白色，由菌根基部至頂端顏色逐漸變淡，菌根頂端透明，發(fā)亮。菌根末端有少量絨毛狀的外延菌絲，外延菌絲稀疏，較細(xì)，無根狀菌索，無囊狀體，無菌核（圖2A，圖2B）。

外層菌套為擬薄壁組織，菌套類型為Q型，菌絲細(xì)胞無規(guī)則膨大，排列整齊，緊密，菌絲細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞壁較薄，彎曲后相互纏繞形成網(wǎng)紋狀，內(nèi)層菌套為密絲組織，菌套類型為E型，菌絲細(xì)胞細(xì)胞壁薄，菌絲分支較多，且膨大，卷曲盤繞，比外層菌套的菌絲纏繞更緊密，形成網(wǎng)眼狀（圖2C，圖2D）。平面觀哈蒂氏網(wǎng)呈網(wǎng)狀，菌絲有隔，無鎖狀聯(lián)合，菌絲細(xì)胞呈圓形，哈蒂氏網(wǎng)深入到整個(gè)外皮層細(xì)胞，達(dá)內(nèi)皮層細(xì)胞的外層（圖2E）。

2.2 分子鑒定

將類型1，類型2所測(cè)的DNA序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，在可比較的堿基范圍內(nèi)進(jìn)行DNA序列同源性比較時(shí)，自動(dòng)濾除了低復(fù)雜性序列（Low-complexity sequence）和未命名的序列，BLAST查詢的結(jié)果表明：類型1與編號(hào)為gi|323903052|gb| GU979037.1|的遼東塊菌T. liaotongenseITS區(qū)段DNA序列同源性為500/504（99%），兩者相比較的score值為905 bits，空位值Gaps=3/504（1%），E值為0.0。因此確定類型1為此種。

類型2與編號(hào)為gi|315666394|gb| HM485403.1|的卡斯蒂利亞塊菌T. castilloiITS區(qū)段DNA序列同源性為518/553（94%）。兩者相比較的score值為815 bits，空位值Gaps=14/553（0%），E值為0.0。BLAST查詢結(jié)果中列出的100個(gè)E值為0.0的主要同源序列中所有都屬于Tuber屬，所以可確定類型2為塊菌屬的一個(gè)種。

3 結(jié)論與討論

從菌根的外部形態(tài)觀察得知：類型1與類型2兩個(gè)類型菌根的顏色均比較淺，其中類型2菌根頂端呈透明狀；菌根系統(tǒng)的分支不多，均只是在菌根表面有少量的外延菌絲而且比較稀疏。從解剖結(jié)構(gòu)上可知：類型1與類型2兩個(gè)類型菌根的外層菌套均為擬薄壁組織，菌絲細(xì)胞的細(xì)胞壁較薄，兩個(gè)類型的菌絲均有隔，無鎖狀聯(lián)合，內(nèi)外層菌套的菌絲均出現(xiàn)不同程度的彎曲，形成網(wǎng)紋狀。類型1與類型2在形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)特征上與之前在白樺Betula platyphylla上發(fā)現(xiàn)的菌根Tuberaceaesp[11]十分相似，具有塊菌屬外生菌根區(qū)別于其他屬外生菌根的典型外部形態(tài)特征及解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，初步可確定為塊菌屬的外生菌根。

進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定可知：類型1，類型2均為塊菌屬的外生菌根真菌，類型1可鑒定到種，為遼東塊菌。

目前，對(duì)塊菌的研究主要集中在系統(tǒng)分類學(xué)、生態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及人工栽培等方面，因塊菌屬子囊果生于地下，采集困難，大多數(shù)種類的地理分布尚不明確，該屬大多數(shù)種類的遺傳多樣性研究還存在一定的困難，此方面的研究鮮見報(bào)道[12-16]。本文通過分子鑒定后對(duì)與樟子松共生的2種塊菌類型外生菌根的外部形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述，既擴(kuò)大了樟子松外生菌根類型的多樣性，為樟子松優(yōu)良鄉(xiāng)土菌種篩選提供理論基礎(chǔ)，又為塊菌屬外生菌根的鑒定及塊菌屬種類的遺傳多樣性分析提供依據(jù)，并豐富了我國北方地區(qū)塊菌菌根真菌資源多樣性。

塊菌屬分類鑒定大多是依據(jù)其子囊果的形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，但許多形態(tài)相似的或相近的種的區(qū)分成為難題，能否通過其所形成的外生菌根的特征及提取 DNA依靠分子生物學(xué)等現(xiàn)代研究手段來尋找更多更可靠的分類證據(jù)？新近的報(bào)道指出：我國的塊菌屬資源豐富，而且獨(dú)特，尚存在著大量的新分類群未被發(fā)現(xiàn)[17-19]，諸多已知的種類通過研究與比對(duì)雖與歐洲及北美地區(qū)的某些種類極其相似，但其分布范圍卻不盡相同，如：樊永軍等[20]人在賀蘭山發(fā)現(xiàn)冬塊菌Tuber brumale在內(nèi)蒙古地區(qū)的新記錄種。因此，針對(duì)我國塊菌屬系統(tǒng)完整的分類描述及大量的資源調(diào)查工作還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

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