銀杏葉黃酮成分聚酰胺薄層色譜鑒別方法研究

李洪玉 陶正升 于瑞峰 吳人杰 壽旦

銀杏葉為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥葉。味甘、苦、澀、平, 歸心、肺經(jīng), 具活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂功效, 臨床用于瘀血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、肺虛咳喘、高脂血癥［1］。主要活性成分為黃酮類(lèi)、萜類(lèi)內(nèi)酯和多糖等成分［2-4］。銀杏葉黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定法有紫外分光光度法［5］和高效液相色譜法等。張?chǎng)蔚龋?］采用自制銀杏葉提取物, 測(cè)定銀杏制劑中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量, 并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較, 結(jié)果對(duì)照提取物測(cè)定法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果均具有精密度高, 穩(wěn)定性、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。楊艷模等［7］以槲皮素為內(nèi)參物, 建立槲皮素與其他6種黃酮類(lèi)成分相對(duì)校正因子, 計(jì)算其他6種成分的含量, 以外標(biāo)法測(cè)定槲皮素, 利用相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)對(duì)其他6種黃酮類(lèi)成分含量測(cè)定, 實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)。黃琴偉等［8］以銀杏葉對(duì)照提取物和銀杏葉總內(nèi)酯對(duì)照提取物為參照, 確立12個(gè)共有峰作為銀杏葉制劑的特征峰, 建立了銀杏葉片、膠囊和滴丸的特征圖譜, 為銀杏葉制劑的質(zhì)量控制提供有效方法。銀杏葉黃酮類(lèi)成分薄層色譜分析常采用硅膠G薄層色譜分析法。賈長(zhǎng)英等［9］采用乙酸乙酯預(yù)浸提銀杏葉粉末, 90%乙醇索氏提取, 點(diǎn)于硅膠G薄層層析板上, 展開(kāi)劑為氯仿∶甲醇∶甲酸∶水(2.5∶2∶1.5∶1.5), 噴以3%三氯化鋁乙醇溶液, 置紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮成分熒光斑點(diǎn), 對(duì)銀杏葉黃酮類(lèi)成分薄層色譜分析。周繼法等［10］選用甲醇為提取溶劑, 水浴加熱回流提取銀杏葉, 過(guò)濾, 濾液作為供試品溶液, 點(diǎn)于硅膠G薄層層析板上, 以正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)上層為展開(kāi)劑, 對(duì)銀菊口服液中的銀杏葉進(jìn)行定性鑒別。2015版中國(guó)藥典銀杏葉黃酮類(lèi)成分薄層色譜分析方法采用40%乙醇加熱回流提取, 點(diǎn)于用4%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板上, 以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑, 噴以3%三氯化鋁乙醇溶液, 置于紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點(diǎn)。聚酰胺薄層色譜也常用于黃酮類(lèi)成分分析, 并且具有點(diǎn)量少、展程短、分離效率高等優(yōu)點(diǎn)。本文采用聚酰胺薄層色譜法用于銀杏葉黃酮類(lèi)成分鑒別, 對(duì)銀杏葉黃酮類(lèi)成分的提取條件、展開(kāi)劑和點(diǎn)樣量等進(jìn)行比較分析, 具體如下。

1 儀器與試藥

薄層層析展開(kāi)缸(120 mm×120 mm);TLC Visualizer型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪)；XMTD-204型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司)；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；20 cm×20 cm聚酰胺薄膜(臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠)。銀杏葉藥材(購(gòu)自廣東中藥民生堂)；同一棵銀杏樹(shù)的樹(shù)葉(采自浙江富陽(yáng)湘溪村)；石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、甲醇、甲酸、三氯化鋁均為分析純；試驗(yàn)用水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品采集 樣品1號(hào)購(gòu)自廣東中藥民生堂的銀杏葉藥材, 樣品為綠色干燥葉。樣品2號(hào)采自浙江富陽(yáng)湘溪村銀杏樹(shù)葉, 鮮葉經(jīng)過(guò)陰干得綠色干燥葉。樣品3號(hào)為上述鮮葉在25℃室溫曬干至綠色剛褪去的黃色干燥葉。樣品4號(hào)采自上述同一棵銀杏樹(shù)的落葉, 為褐色干燥葉。

2.2 銀杏葉黃酮類(lèi)成分提取方法比較

2.2.1 乙醇超聲提取 取樣品1號(hào)銀杏葉藥材粉末約1 g,精密稱(chēng)定, 加95%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min, 過(guò)濾 , 點(diǎn)樣。

2.2.2 70%乙醇超聲提取 取樣品1號(hào)粉末約1 g, 精密稱(chēng)定, 加70%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min,過(guò)濾, 點(diǎn)樣。

2.2.3 50%乙醇超聲提取 取樣品1號(hào)粉末約1 g, 精密稱(chēng)定, 加50%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min,過(guò)濾, 點(diǎn)樣。

圖1 不同乙醇提取濃度薄層色譜圖

2.2.4 乙酸乙酯脫酯乙醇超聲提取 取樣品1號(hào)粉末約1 g,精密稱(chēng)定, 加乙酸乙酯20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min, 濾去乙酸乙酯, 粉末在60℃條件下烘干, 加95%乙醇20 ml, 超聲提取30 min, 過(guò)濾, 取 5ml濾液置蒸發(fā)皿中水浴蒸干, 2 ml乙醇溶解, 點(diǎn)樣。

2.2.5 乙醇超聲提取正丁醇萃取 取樣品1號(hào)粉末約1 g,精密稱(chēng)定, 加95%乙醇20 ml置100 ml錐形瓶中, 超聲提取30 min, 過(guò)濾, 濾液置60 ml分液漏斗中, 加石油醚20 ml萃取1次, 下層加20 ml水飽和的正丁醇萃取1次, 取5 ml正丁醇萃取液置蒸發(fā)皿中水浴蒸干, 2 ml乙醇溶解, 點(diǎn)樣。

上述五種方法經(jīng)聚酰胺薄層色譜展開(kāi), 置于紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點(diǎn), 結(jié)果顯示2.2.1項(xiàng)下提取方法最好。見(jiàn)圖1, 圖2。

2.3 聚酰胺薄層色譜展開(kāi)劑條件比較 采用2.2.1項(xiàng)下的提取方法制備供試品溶液, 進(jìn)行薄層色譜比較, 分別采用展開(kāi)劑1∶甲醇；展開(kāi)劑2∶甲醇∶水(7∶3)；展開(kāi)劑3∶甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)進(jìn)行比較。展開(kāi)距離5 cm；顯色劑為3%三氯化鋁乙醇溶液, 比較不同展開(kāi)劑的分離效果。

置于紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點(diǎn), 結(jié)果顯示展開(kāi)劑3∶甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)分離效果最佳, 明顯優(yōu)于展開(kāi)劑1∶甲醇和展開(kāi)劑2∶甲醇∶水(7∶3)。因此,選擇甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)為展開(kāi)劑。見(jiàn)圖3, 圖4,圖5。

2.4 不同點(diǎn)樣量的比較 采用2.2.1項(xiàng)下的提取方法制備供試品溶液, 分別以1、3、5 μl為點(diǎn)樣量, 以2.3項(xiàng)下的展開(kāi)劑展開(kāi), 展開(kāi)距離5 cm。點(diǎn)樣量3 μl薄層色譜圖黃酮成分熒光斑點(diǎn)分離清晰大小適中。見(jiàn)圖6。

2.5 不同加工方法銀杏葉樣品黃酮類(lèi)成分薄層色譜 取不同加工方法的銀杏葉樣品, 采用2.2.1項(xiàng)下的提取方法制備供試品溶液, 以2.3項(xiàng)下的展開(kāi)劑展開(kāi), 點(diǎn)樣量3 μl, 展開(kāi)距離5 cm。不同加工方法銀杏葉樣品薄層色譜黃酮類(lèi)成分熒光斑點(diǎn)清晰, 分離度和Rf值均較理想。見(jiàn)圖7。

圖2 不同乙醇提取分離條件薄層色譜圖

圖3 甲醇展開(kāi)劑薄層色譜圖

圖4 甲醇:水展開(kāi)劑薄層色譜圖

圖5 甲醇∶丙酮∶水展開(kāi)劑薄層色譜圖

圖6 不同點(diǎn)樣量的薄層色譜圖

圖7 不同加工方法銀杏葉薄層色譜圖

3 討論

銀杏葉粉末黃酮成分中國(guó)藥典采用40%乙醇加熱回流提取, 洪美華等［11］比較熱回流提取和超聲提取, 結(jié)果一致,超聲方法簡(jiǎn)單穩(wěn)定。本文采用超聲提取方法, 同時(shí)對(duì)5種不同的黃酮成分提取分離條件通過(guò)薄層色譜圖黃酮成分熒光斑點(diǎn)進(jìn)行比較, 結(jié)果95%乙醇超聲提取法效果最好, 95%乙醇超聲提取薄層色譜圖黃酮成分熒光斑點(diǎn)明顯大于正丁醇萃取法和乙酸乙酯脫酯法, 說(shuō)明乙酸乙酯脫酯和正丁醇萃取過(guò)程中黃酮類(lèi)成分有損失。

聚酰胺薄層色譜不同展開(kāi)劑甲醇、甲醇∶水(7∶3)和甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)比較：甲醇為展開(kāi)劑紫外光燈(365 nm)下檢視黃酮熒光斑點(diǎn), 結(jié)果顯示出黃酮類(lèi)成分2個(gè)主要熒光斑點(diǎn)和2個(gè)弱熒光斑點(diǎn)；甲醇∶水(7∶3)為展開(kāi)劑顯示出1個(gè)主要熒光斑點(diǎn)和1個(gè)弱熒光斑點(diǎn), 其他黃酮類(lèi)成分熒光斑點(diǎn)沒(méi)有分離開(kāi)；甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)為展開(kāi)劑顯示出4個(gè)主要熒光斑點(diǎn)和3個(gè)弱熒光斑點(diǎn)。展開(kāi)劑甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)好于甲醇展開(kāi)劑和甲醇∶水(7∶3)展開(kāi)劑。甲醇∶水(7∶3)展開(kāi)劑中加入丙酮展開(kāi)劑形成甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)展開(kāi)劑, 展開(kāi)黃酮類(lèi)成分的效果好, 可能是丙酮和黃酮類(lèi)成分的分子結(jié)構(gòu)中都有羰基結(jié)構(gòu)相似相溶, 更易于黃酮類(lèi)成分的展開(kāi)。

銀杏葉采集加工中國(guó)藥典規(guī)定秋季葉尚綠時(shí)采收, 及時(shí)干燥, 但沒(méi)有規(guī)定具體干燥方法, 羅實(shí)等［12］采用直接烘烤、曬干后烘烤、殺青晾置后烘烤、微波和恒溫鼓風(fēng)5種方法干燥銀杏鮮葉, 以銀杏葉總黃酮醇苷和總萜類(lèi)內(nèi)酯含量為評(píng)價(jià)指標(biāo), 結(jié)果恒溫鼓風(fēng)干燥方法最佳。蔣明廉［13］以黃酮類(lèi)成分為指標(biāo)采集同一棵樹(shù)葉比較了鮮葉、生曬葉、陰干葉、冷藏葉、60℃干燥葉和80℃干燥葉, 結(jié)果以鮮葉和陰干葉為好。本文采集同一棵銀杏樹(shù)葉, 用陰干和室溫干燥的加工方法, 對(duì)3種不同顏色銀杏樹(shù)葉黃酮類(lèi)成分薄層色譜鑒別分析,3種不同顏色銀杏樹(shù)葉均含有黃酮類(lèi)成分, 若評(píng)價(jià)其質(zhì)量還需結(jié)合銀杏葉總黃酮含量等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

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