紅麻酮脂酰輔酶A合成酶（KCS）酵母雙雜交誘餌載體構(gòu)建及自激活檢測(cè)

張高陽，鄧接樓，黃思齊，李德芳*

（1.江西上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒334001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙410205）

酵母雙雜交技術(shù)于1989年由Fields等最先應(yīng)用，是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺(tái)，其試驗(yàn)過程中省去了蛋白質(zhì)表達(dá)純化及抗體制備的繁瑣步驟，因其簡(jiǎn)便、快捷、高通量篩選，能夠反映在正常生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的活性特征等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用方面的研究［1］。

紅麻（Hibiscus cannabinus）為錦葵科木槿一年生草本韌皮纖維作物，富含大量?jī)?yōu)質(zhì)天然纖維素，是目前世界上麻紡工業(yè)重要的原料［2］。β－酮脂酰－CoA合成酶（Ketoacyl coenzyme A synthetase，KCS）是植物體內(nèi)超長(zhǎng)鏈脂肪酸和表皮蠟質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，表皮蠟質(zhì)是防止植物水分散失和抵御不良環(huán)境危害的重要屏障，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫方面具有重要作用［3，4］。目前，有關(guān)KCS基因的研究主要集中在對(duì)其基因序列和功能的研究上，而對(duì)該基因的作用網(wǎng)絡(luò)以及與體內(nèi)蛋白和蛋白之間的相互作用研究目前尚未見報(bào)道。因此，本研究主要集中構(gòu)建紅麻酮脂酰輔酶A合成酶（KCS）酵母雙雜交誘餌載體并檢測(cè)該蛋白自激活活性，旨在為下一步利用酵母雙雜交研究與酮脂酰輔酶A合成酶相互作用的蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株Mav103、DB3.1、pGBKT7質(zhì)粒、salmon DNA購(gòu)自美國(guó)biolab公司；篩選培養(yǎng)基SD／－Trp、SD／－Trp－His、SD／－Trp－His－Ura、X－Gal購(gòu)自美國(guó) Clontech公司；DNA限制內(nèi)切酶、T4連接酶、Blue taq DNA聚合酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物由華大基因合成；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 KCS基因片段獲得及誘餌載體構(gòu)建

提取紅麻葉片RNA，采用AccuScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，根據(jù)基因和載體序列信息設(shè)計(jì)KCS基因擴(kuò)增引物，上游引物5’－GAATTCTCCCCTCTGTCGTGCAAGACAATGC－3’；下游引物5’－GCGGCCGCCTAGAGCTTGACAACTTCGGGGATG－3’，以 cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，利用EcoRⅠ、NotⅠ酶分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pGBKT7質(zhì)粒進(jìn)行酶切，PCR產(chǎn)物和酶切載體回收純化后，利用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7－KCS。

1.2.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及載體轉(zhuǎn)化

挑取單個(gè)Mav103酵母菌，接種于50 mL YPD培養(yǎng)基中，于30℃以250 r／min振蕩培養(yǎng)16～18 h至A600nm在0.3～0.5之間。然后室溫離心（4000 rpm／min）5 min收集酵母細(xì)胞，棄上清，加入50 mL無菌水重懸菌體，離心5 min，沉淀用1.5 mL 1 X TE／LiAc重懸，離心，再用600μL 1 X TE／LiAc重懸菌體，酵母感受態(tài)細(xì)胞置于冰上備用。操作之前準(zhǔn)備PEG／LiAc溶液，以此加入誘餌載體3μL、Carrier DNA 4μL（20 mg／mL）、50μL酵母感受態(tài)細(xì)胞及0.6 mL PEG／LiAc溶液于1.5 mL離心管中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照質(zhì)粒、陽性對(duì)照質(zhì)粒，顛倒混勻后，置于30℃ 水浴30 min，每隔10 min顛倒混勻一次，30 min后加入20μL 100%DMSO溶液，混勻，于42℃熱激15 min，每隔5 min混勻一次，冰浴5 min。于室溫以3000 rpm／min離心5 min。棄上清，用1 mL YPD培養(yǎng)基重懸菌體，離心，棄上清，用0.5%NaCl重懸菌體，取50μL菌液涂布于相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷平板上，于30℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3 誘餌表達(dá)載體pGBKT7－KCS自激活檢測(cè)

待酵母培養(yǎng)3～5 d生長(zhǎng)至3～5 mm時(shí)，用槍頭挑取酵母放入1.5 mL離心管中，置于液氮中，然后取出于室溫待其融化，反復(fù)5次，加入100μL無菌水作為模板，用PCR驗(yàn)證表達(dá)載體pGBKT7－KCS，驗(yàn)證正確的酵母轉(zhuǎn)移至SD－Leu培養(yǎng)上，培養(yǎng)3～5 d后，用NC膜將菌體復(fù)印在膜上，將沾有酵母的NC膜放入液氮中，反復(fù)3次，放入X－Gal染液中于30℃培養(yǎng)，30 min后觀察菌落的顏色變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 KCS基因分離和誘餌載體構(gòu)建

根據(jù)KCS基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（F：5’－GAATTCTCCCCTCTGTCGTGCAAGACAATGC－3’，R：5’－GCGGCCGCCTAGAGCTTGACAACTTCGGGGATG－3’），PCR擴(kuò)增后用2%的凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示有一條900 bp左右的條帶（圖1），經(jīng)回收測(cè)序驗(yàn)證后，將PCR產(chǎn)物與載體雙酶切連接，繼而轉(zhuǎn)化DB3.1細(xì)菌，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、NotⅠ酶對(duì)質(zhì)粒酶切電泳后，發(fā)現(xiàn)一條與預(yù)期大小一致的片段（圖1），表明載體構(gòu)建正確，可用于下一步轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

圖1 KCS基因分離及酶切鑒定Fig.1 The isolation and enzyme digesting identification of KCSgene

2.2 轉(zhuǎn)化酵母基因型鑒定

待缺陷培養(yǎng)基上長(zhǎng)出酵母單克隆后，用無菌槍頭挑取少量菌體于1.5 mL離心管中，以反復(fù)凍融后的菌體為模板，基因特異引物5’－CAATCGGACCGTTGGTTCTCCCGGC－3’和載體測(cè)序引物5’－GCAAAATTTTGGATTCTCAG－3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，單克隆能擴(kuò)增出一條800 bp左右的目的條帶（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)化酵母基因型鑒定Fig.2 The genotype detection of transformation yeast

2.3 酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7－KCS自激活檢測(cè)

經(jīng)驗(yàn)證正確的酵母單克隆轉(zhuǎn)移至SD－Leu篩選培養(yǎng)基上，待3～5 d后酵母細(xì)胞長(zhǎng)至3.5 mm時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至NC膜上，并置于液氮中反復(fù)凍融3次后放入預(yù)先備好的染色液中（Z buffer，10 mg／mL X－Gal），30 min后觀察酵母細(xì)胞顏色變化情況。結(jié)果顯示（見圖3），酵母陽性克隆細(xì)胞由白色變?yōu)樗{(lán)色，說明KCS蛋白上游DNA Binding Domain可與GAL4轉(zhuǎn)錄因子的上游激活位點(diǎn)（UAS）結(jié)合，自動(dòng)激活報(bào)告基因β－半乳糖苷酶表達(dá)，將KCS基因DNA Binding Domain刪除后，KCS蛋白在酵母中不具有自激活，可用于后期酵母雙雜交的誘餌蛋白研究與之相互作用的蛋白。

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間相互作用的方法之一，具有很高靈敏度，可以檢測(cè)到蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的相互作用。酵母雙雜交技術(shù)不僅可以用來研究哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)之間的互作，還可以用來研究高等植物蛋白質(zhì)之間的互作，因此，在目前生物學(xué)研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用［5］。KCS基因是超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸過程中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)蠟質(zhì)成分前體的合成，表皮蠟質(zhì)與植物防止非氣孔性失水、機(jī)械損傷、低溫凍傷、病毒侵害、花粉與柱頭的信號(hào)識(shí)別、植物形態(tài)發(fā)育與育性等都密切相關(guān)［6－10］。目前，有關(guān)紅麻KCS蛋白在酵母中的研究還沒有報(bào)道。本研究構(gòu)建紅麻β－ketoacyl－coa synthase基因誘餌載體，結(jié)果顯示，該蛋白DNA binding區(qū)域能與酵母GAL4轉(zhuǎn)錄因子的上游激活位點(diǎn)（UAS）結(jié)合，自動(dòng)激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，把KCS基因DNA Binding Domain刪除后，KCS蛋白在酵母中不具有自激活，因此，可用于后期酵母雙雜交的誘餌蛋白研究與之相互作用的蛋白。

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