基于雙抗夾心ELISA法來檢測血漿中凝血酶

摘要：雙抗體夾心ELISA法是最常使用的免疫分析技術(shù)，目前在各個領(lǐng)域都取得了廣泛的運用。通過分析該方法在其他領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，再結(jié)合該方法在檢測凝血酶中的運用，得出采用ELISA法來檢測血漿中凝血酶原的含量，具有較高的有效性、穩(wěn)定性，在臨床中可以廣泛地應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：雙抗夾心ELISA法;凝血酶;穩(wěn)定性

凝血酶原就是凝血因子Ⅱ，它主要依賴于維生素K，在肝臟中經(jīng)過肝細胞合成，經(jīng)過活化可以轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的凝血酶。在對眾多疾病的發(fā)病機制和臨床癥狀進行研究時，測量凝血酶的含量具有十分重要的意義，但現(xiàn)階段臨床檢驗中尚不存在高效、簡便及準確的方法來檢測凝血酶。目前，雙抗夾心ELISA法是使用最廣泛的一種免疫分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用到臨床檢測、毒品測定等各個領(lǐng)域。

1雙抗體夾心 ELISA 法的研究進展

莊翹楚等^[1]研究分析了雙抗夾心ELISA法對雙歧桿菌進行檢測的最優(yōu)反應(yīng)條件。采用實驗室所提取的兔抗及鼠抗兩種兩歧雙歧桿菌免疫血清，運用相應(yīng)的方法來篩選兩種血清的反應(yīng)濃度，之后再對比分析反應(yīng)所需的封閉液、反應(yīng)所需時間及底物反應(yīng)所需時間等，從而明確雙抗夾心ELISA法對雙歧桿菌進行檢測的最優(yōu)條件，為日后測定雙歧桿菌的含量提供有效的依據(jù)。吳序櫟等^[2]分析研究了雙抗夾心ELISA法對食物中蝦過敏原的測定方法及效果，為有效的預(yù)防及治療食物過敏提供了可靠的理論依據(jù)。其方法為：分離提取蝦中的過敏原蛋白，利用免疫小鼠制作出相應(yīng)的抗體，同時將該抗體作為包被酶標板，利用生物素來為抗體做標記，創(chuàng)建起科學(xué)的雙抗夾心ELISA法，成功檢測出蝦過敏原的成分，該方法具有較強的靈敏度，為深入研究ELISA法檢測蝦過敏原提供了有效的依據(jù)。何啟強等^[3]分析研究了雙抗夾心ELISA法測量HSP70的含量，創(chuàng)建相應(yīng)的標準曲線，測定出了相應(yīng)的回收率、精準度及檢出限的最下值，結(jié)果顯示采用該方法來測定HSP70具有較多的優(yōu)點，如較高的靈敏度、特異性及可靠性。陳家杰等^[4]創(chuàng)建了有效的雙抗夾心ELISA法，并運用該方法對食物中大豆的過敏原成分進行檢測，從而為預(yù)防及治療食物過敏性疾病提供了相應(yīng)的技術(shù)支持。分離大豆的總蛋白，利用免疫小鼠制定出相應(yīng)的抗體，同時運用將該抗體作為包被物質(zhì)，并采用生物素來標記抗體，將其作為捕捉抗體，從而創(chuàng)建科學(xué)有效的雙抗夾心ELISA法。該方法具備較高的靈敏度及可靠性，能夠同時對十種樣品的過敏原含量進行測定。

2雙抗夾心ELISA法檢測凝血酶的實際應(yīng)用

2.1研究材料及研究方法

正常對照組：選取一定的數(shù)量的健康人，對其進行體檢，排除肝、腎等病史，排除出血癥狀，近期內(nèi)沒有服藥史。

肝硬化組：根據(jù)我國所制定的相關(guān)診斷標準，選取一部分符合診斷標準的病例，其均由消化?？频尼t(yī)師進行確診。

提取血漿時所運用的抗凝劑為枸櫞酸。

2.2研究儀器及研究試劑

研究試劑：兔抗人凝血酶原抗體，過氧化物酶標記的兔抗人凝血酶原抗體，凝血酶原標準品，牛血清白蛋白等。

研究儀器：酶標儀與洗板機等。

2.3研究方法

根據(jù)常規(guī)的方法來檢測血漿中的凝血酶。其操作步驟如下：選用已被兔抗人凝血酶抗體包被的96微孔板，每孔注入100ul的液體，在溫度為14℃的條件下過夜。封閉液所運用的為0.5%的BSA，在37℃的條件下放置半小時。洗滌液選用PBS，經(jīng)過標準的洗滌之后，在微孔板內(nèi)加入梯度稀釋的凝血酶原標準品及樣本血漿，每個孔注入100ul，兩個平衡，在37℃的條件下放置一小時。同時對過氧化物酶標記的兔抗人凝血酶原抗體進行稀釋，經(jīng)過標準的洗滌之后，將其加入其中，在37℃的條件下放置半小時。經(jīng)過標準的洗滌之后，將相應(yīng)的顯色劑加入到96微孔板內(nèi)，采用硫酸來終止該反應(yīng)。最后運用酶標儀進行測量，吸光度值為450nm。

2.4研究結(jié)果

2.4.1正交試驗優(yōu)選

該試驗可以對包被液的濃度、過氧化物酶標記的抗凝血酶原抗體稀釋比例以及封閉液的類型進行優(yōu)化選擇，得出最佳的包被濃度為10 mg/L，相應(yīng)的抗體稀釋比例為1：1000，而封閉液則運用了0.5%的BSA。

2.4.2線性分析

利用PBS來稀釋凝血酶原的標準品，其具體的稀釋比例為1：5、2：5、3：5、4：5及原有濃度。采用雙抗夾心ELISA法來檢測凝血酶數(shù)值，結(jié)果顯示在該范圍之內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.4.3靈敏度

采用零標準管進行反復(fù)檢測，至少保持10次，得出最小檢測限，在相應(yīng)的吸光度值下進行測量，得出相關(guān)的標準曲線，通過計算得出相應(yīng)的凝血酶濃度，其數(shù)值為7.5mg/L。

2.4.4檢測回收率

取已知凝血酶一份，其濃度為5mg/L，通過常規(guī)檢測，將標準品以500、1000 mg/L的量加入其中，檢測回收率，計算出所需數(shù)值。

2.4.5檢測重復(fù)性

取已知的凝血酶，其原有含量為5 mg/L，采取相關(guān)的方法進行檢測，得出相應(yīng)的重復(fù)性。

2.4.6樣本的稀釋比例

為了使非特異性的吸附度降低，經(jīng)過相關(guān)的實驗得出，以1：1000的比例來稀釋血清樣本。

2.4.7研究樣本存放時間的影響

處于無菌的條件下，將新鮮的血液進行分離，提取出血漿，將其處于4℃的溫度環(huán)境中放置一周，在零下20℃的溫度環(huán)境中放置一個月，經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)并未對最終數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響。

3討論

大部分凝血因子及抗凝血因子都是在肝臟中合成及失活的，患有肝病的患者多存在嚴重的凝血功能障礙。肝硬化患者最常見的臨床癥狀是出血，其造成出血的主要原因是由于肝臟中合成凝血因子及血小板等含量的降低，肝臟功能異常所導(dǎo)致。相關(guān)的研究多集中于肝硬化患者的凝血及止血功能的檢測意義，極少涉及凝血酶原的含量測定。經(jīng)過試驗檢測，肝硬化患者的凝血酶原含量呈現(xiàn)顯著降低，雙抗夾心ELISA法能夠有效的測定出肝硬化患者的凝血酶原含量，該檢測方法具有較高的可靠性及精確性，能夠作為早期肝功能指標的檢測方法。

運用雙抗夾心ELISA法對正常人的凝血酶原含量進行檢測，通過與以往的文獻進行對比分析，得出該方法與其他方法所檢測出的結(jié)果基本相同。目前，臨床上多采用凝血酶原的檢測來呈現(xiàn)集體內(nèi)外源性凝血途徑的情況，但此方法所應(yīng)用的范圍較為有限，僅僅用于外源性凝血系統(tǒng)凝血因子缺陷的初篩。本文通過雙抗夾心ELISA法來測量凝血酶原的含量，結(jié)果顯示，各個指標均與相關(guān)的檢測要求相符合。

結(jié)論

雙抗夾心ELISA 法具有較多的優(yōu)勢，如高效、迅速、精確、可定量、易操作、所需的大型設(shè)備較少等，且該方法并不需要較高的樣品純度，十分適用于批量較多的樣品檢測，其具有極快的發(fā)展速度，在臨床上取得了廣泛的應(yīng)用。

參考文獻

[1]莊翹楚，孟祥晨.雙抗夾ELISA法檢測雙歧桿菌反應(yīng)條件的優(yōu)化[J].中國乳品工業(yè)，2008，36（5）：55-58.

[2]吳序櫟，吉坤美，李佳娜，et al.雙抗體夾心ELISA法測定食物中蝦過敏原成分[J].食品科技，2009（8）：240-243.

[3]何啟強，楊進波，肖成峰，et al.雙抗夾心ELISA法檢測血漿HSP70的建立及初步應(yīng)用[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2004，21（1）：27-30.

[4]陳家杰，朱海，葉衛(wèi)翔，et al.雙抗體夾心ELISA法測定食物中大豆過敏原蛋白成分[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（5）：105-109.

作者簡介：王飛（1989.09-），性別：女，民族：漢，籍貫：天津市，當前職務(wù)：實驗員，當前職稱：初級工程師，學(xué)歷：本科，研究方向：分子生物學(xué)ELISA。

（作者單位：凱熙醫(yī)藥（天津）有限公司）