基于氧化應激探討松齡血脈康對自發(fā)性高血壓大鼠血管的保護機制

施偉麗 袁蓉 信琪琪 徐磊 滕傳震 叢偉紅

【摘要】探討松齡血脈康膠囊對高血壓狀態(tài)下大鼠氧化應激損傷的保護作用及機制。將自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為模型組、氯沙坦鉀組、松齡血脈康高劑量組和、松齡血脈康常規(guī)劑量組，Wistar Kyoto大鼠（WKY）作為正常對照組，連續(xù)給藥9周。生化法檢測血清中氧化應激因子NO濃度、SOD活力、MDA含量。以Masson染色觀察藥物對大鼠主動脈病理組織形態(tài)學影響。借助qPCR陣列技術檢測氧化應激相關因子RNA水平的變化，繼而借助String及KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫對差異基因進行網(wǎng)絡分析。與對照組比較，高血壓模型組血清NO濃度明顯降低（P<0.01），MDA濃度明顯升高（P<0.05），提示自發(fā)性高血壓大鼠血清氧化能力增強。給藥后，與模型組比較，氯沙坦鉀組、松齡血脈康大劑量組、松齡血脈康中劑量組MDA濃度均顯著降低（P均<0.001）。各組間SOD活力未見明顯變化（P>0.05）。qPCR陣列檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，高劑量松齡血脈康組共得到9個差異倍數(shù)大于2的基因，其中Gch1、FOS、IGF1R基因表達量上調(diào)，PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN、HSPA1B表達量下調(diào)。其中CAV1和IGF1R與氧化應激密切相關，松齡血脈康膠囊可能通過調(diào)節(jié)CAV1和IGF1R基因表達，減輕高血壓狀態(tài)下大鼠主動脈氧化應激損傷。

【關鍵詞】松齡血脈康膠囊；自發(fā)性高血壓大鼠；氧化應激

【中圖分類號】R544.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.6..04

【Abstract】To investigate the protective effect and mechanism of Songling Xuemaikang Capsule（SXC）on oxidative stress injury in spontaneously hypertensive rats（SHR）.SHR were randomly divided into model group，high dose SXC group （H-SXC），normal dose SXC group （ N-SXC） and losartan group，and WKY rats served as control.Rats were administered continuously for 9 weeks.Oxidative stress related factors including NO，SOD and MDA were detected by biochemical method.Masson staining was used to observe pathological morphology of the aorta.QPCR array technique was used to detect changes of oxidative stress related factors， and then network of differential genes were analyzed with String and KEGG Pathway databases. Compared with the control group， NO concentration of model group was significantly descended （P<0.01），and the concentration of MDA increased obviously （P<0.05）.Compared with model group，concentration of MDA in losartan group，H-SXC and N-SXC were decreased significantly（P<0.001）.There was no statistical significance for SOD activity in each group （P>0.05）.75 variable genes were screened through qPCR array detection.Compared with the model group，H-SXC group received 9 differentially expressed genes，which fold change was more than 2.And Gch1， FOS and IGF1R gene expression were up regulated， while PIK3CG， GPx2， CAV1，SOD1，PTEN and HSPA1B were down regulated.H-SXC can alleviate oxidative stress by regulating genes expression of CAV1 and IGF1R in hypertensive rats.

【Key words】Songling xuemaikang capsule；Spontaneously hypertensive rats；oxidative stress

血管收縮和舒張功能障礙是血壓異常的關鍵環(huán)節(jié)，氧化應激是血管損傷的重要因素。越來越多的研究提示，氧化應激參與高血壓病的發(fā)生和發(fā)展，其機制可能與氧化損傷血管內(nèi)皮，影響血管功能有關[1-2]。這也提示，藥物通過調(diào)節(jié)血管氧化應激水平、恢復血管功能，可能成為治療高血壓病新的探索方向。本課題組前期實驗結(jié)果表明松齡血脈康膠囊能降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[3]，同時提示其降壓作用可能與抗氧化應激有關。故本研究借助qPCR陣列技術及String數(shù)據(jù)庫，以自發(fā)性高血壓大鼠為模型，進一步研究松齡血脈康對血管的保護作用，以期為松齡血脈康的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

9周齡SPF級雄性Wistar Kyoto大鼠（WKY）10只，自發(fā)性高血壓大鼠40只，均購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證書號SYXK（京）2012-0012。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院SPF級動物房，自由飲水及取食。

1.2 實驗藥物及試劑

松齡血康膠囊由成都康弘有限公司提供（批號160216），該膠囊主要由鮮松葉、葛根、珍珠層粉組成，0.5 g/粒；氯沙坦鉀片由杭州默沙東制藥有限公司提供（批號L016172），100 mg/粒。

1.3 試劑

一步法NO試劑盒（批號A013-2）、丙二醛（MDA）測試盒（批號20160804）、SOD試劑盒（WST-1法）（批號A001-3）均購自南京建成生物有限公司。RNA提取試劑盒（批號11667165001）購自Roche公司，All-in-One? First-Strand cDNA 合成試劑盒（批號AORT-0050），All-in-OneTM qPCR Mix及引物（批號AOPR-0200），購自GeneCopoeia公司。

1.3 實驗儀器

脫水機（武漢俊杰電子有限公司：JJ-12J），包埋機（武漢俊杰電子有限公司：JB-P5），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司：RM2016），組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司：KD-P），烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司：DHG-9140A），酶標儀（Biotek：Stnergy-4），正置光學顯微鏡（日本尼康：ECLIPSE CI），成像系統(tǒng)（日本尼康：DS-U3），LightCycler480 PCR儀（美國羅氏）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥方法

40只9周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組（模型組、氯沙坦鉀組、高劑量松齡血脈康組和常規(guī)劑量松齡血脈康組），每組10只，以WKY大鼠為正常對照組。氯沙坦鉀片研磨后按每天31.5 mg·kg-1灌胃給藥，高劑量松齡血脈康組以每天1g·kg-1灌胃，常規(guī)劑量松齡血脈康組以每天0.5g·kg-1灌胃，模型組及正常對照組給予等體積生理鹽水，給藥9周。

2.2 病理組織學檢測

胸主動脈用福爾馬林固定、石臘包埋、切片后Masson染色，觀察主動脈纖維化程度。

2.3 血清氧化因子檢測

血清NO、SOD和MDA檢測均用南京建成生物工程研究所制備的試劑盒，其中NO采用硝酸還原酶法，SOD活力測定用黃嘌呤氧化酶法，MDA檢測用硫代巴比妥酸法。操作按試劑盒說明書要求進行，根據(jù)各孔的吸光度計算濃度及活力。

2.4 qPCR陣列檢測

模型組和高劑量松齡血脈康膠囊組分別提供5個主動脈組織，用All-in-OneTM first-strand cDNA synthesis試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；后將All-in-OneTM qPCR mix與cDNA模板混合，將混合液滴入qPCR陣列孔中；Real-time PCR儀中反應；用GeneCopoeia的網(wǎng)上數(shù)據(jù)分析工具分析數(shù)據(jù)。

2.5 所得差異基因的網(wǎng)絡分析

結(jié)合String（http：//www.string-db.org）數(shù)據(jù)庫對所得基因進行網(wǎng)絡分析。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以“x±s”表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)（n），百分數(shù)（%）表示，采用x2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 松齡血脈康膠囊對主動脈纖維化程度影響

通過馬松染色可以觀察主動脈纖維化程度，從圖1-A2、B2中可以看出模型組主動脈內(nèi)中膜厚度增加，同時膠原纖維增生明顯（藍綠色膠原纖維增生明顯，掩蓋正常紅色肌纖維）。藥物干預后與模型組比較，氯沙坦鉀組、松齡血脈康高劑量組主動脈內(nèi)中膜厚度減小，同時膠原纖維增生程度減輕，紅色平滑肌纖維尚清晰（見圖1）。

3.2 松齡血脈康膠囊對血清中氧化應激因子的影響

NO水平的消長是調(diào)節(jié)氧化和抗氧化的關鍵環(huán)節(jié)，與對照組比較，高血壓模型組血清NO濃度明顯降低（P<0.01），MDA濃度明顯升高（P<0.05），提示自發(fā)性高血壓大鼠血清氧化能力增強。各組間SOD活力未見明顯變化（P>0.05）。給藥后，與模型組比較，氯沙坦鉀組NO濃度顯著升高（P<0.01），MDA濃度顯著降低（P<0.001）。松齡血脈康大劑量組和中劑量組MDA濃度較模型組均明顯降低（P<0.001），NO濃度較模型組有升高趨勢，但未見明顯統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

3.3 松齡血脈康膠囊對氧化應激相關基因的調(diào)控分析

3.3.1 松齡血脈康組與模型組比較，差異表達基因結(jié)果

本研究通過qPCR陣列檢測，共篩到75個有變化基因。高劑量松齡血脈康組與模型組比較差異倍數(shù)大于2的基因有9個，其中Gch1、FOS、IGF1R基因上調(diào)，PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN、HSPA1B基因表達量下調(diào)（見表2）。

3.3.2 借助String數(shù)據(jù)平臺對差異表達基因分析結(jié)果

String數(shù)據(jù)庫能夠?qū)Χ鄠€基因進行網(wǎng)絡分析，將差異表達基因Gch1、FOS、IGF1R、PIK3CG、GPx2、CAV1、SOD1、PTEN及HSPA1B放入該數(shù)據(jù)庫進行分析得到。見圖2。從圖中可以看出FOS、IGF1R、PIK3CG、CAV1及PTEN關系密切，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)IGF1R及CAV1與氧化應激密切相關。

4 討 論

高血壓病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其發(fā)病機制尚未完全明確，目前認為血壓異常升高與腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)激活、交感神經(jīng)異常興奮、鈉攝入過多等有關，不管何種因素，均無法全面解釋高血壓病的機制。隨著對高血壓機制研究的深入，人們越來越認識到氧化應激在高血壓病中的重要作用。松齡血脈康膠囊主由葛根、鮮松葉、珍珠層粉組成，具有平肝潛陽、鎮(zhèn)心安神的功效。長期持續(xù)高血壓可引起全身動脈疾病，表現(xiàn)為動脈中層平滑肌細胞增殖和纖維化、管壁增厚和管腔狹窄，本研究中松齡血脈康膠囊能改善動脈纖維化程度，但這種藥效是繼發(fā)于大鼠血壓的下降，還是藥物直接作用于動脈獲得的療效，還尚待研究。此外，松齡血脈康可減輕長期高血壓狀態(tài)下大鼠主動脈氧化應激損傷，該作用可能與松齡血脈康調(diào)節(jié)小凹蛋白（caveolin，CAV1）和胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）基因表達有關。

小凹是由小凹蛋白、膽固醇及鞘脂共同組成的具有轉(zhuǎn)運膽固醇、信號傳導等功能的細胞結(jié)構(gòu)。小凹蛋白是組成小凹的主要骨架蛋白，可負性調(diào)控眾多蛋白酶活性。CAV1是小凹形成不可缺少的的關鍵蛋白之一，在血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞分布廣泛，可通過其腳手架域中相關的氨基酸殘基來實現(xiàn)其對其他蛋白活性的調(diào)控[4]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）是細胞膜小凹上發(fā)現(xiàn)的第一個非受體蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，CAV1通過其腳手架域，與eNOS相互作用并抑制eNOS活性，負性調(diào)控NO生成[5]。Drab等[6]用CAV1基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)基礎狀態(tài)下NO、cGMP的表達都明顯高于野生型鼠，缺少CAV1蛋白小鼠的主動脈缺乏穩(wěn)定的收縮力，乙酰膽堿干預后舒張反應增加，對苯腎上腺素的反應降低。提示CAV1的缺少可能使肌張力降低，全身血壓下降[7]。本研究中CAV1基因表達下調(diào)，提示松齡血脈康膠囊可能通過降低CAV1表達，增加NO生成。

胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是一種多肽類物質(zhì)，是體內(nèi)多種細胞自分泌和旁分泌的產(chǎn)物。在體內(nèi)有胰島素樣作用，在體外能促進細胞增殖。在氧化應激狀態(tài)下，血管平滑肌細胞IGF1R表達受到抑制，這可能與p53和HDAC蛋白激活有關[8]。Baregamian等[9]用過氧化氫氧化損傷大鼠腸上皮細胞，發(fā)現(xiàn)通過抑制IGF1R的表達，增加細胞凋亡，提示IGF1R有抗氧化應激保護腸上皮細胞的作用。Amina等[10] 用6-羥基多巴胺注入大鼠紋狀體，制作多巴胺缺乏的帕金森模型，后給予IGF1治療，發(fā)現(xiàn)IGF1能保護黑質(zhì)和紋狀體，減少氧化損傷，同時也發(fā)現(xiàn)這種保護作用先于AKT、ERK1/2等促生存因子的激活，提示IGF1同樣有抗氧化應激作用。本研究中大劑量松齡血脈康組IGF1R基因表達量較模型組上調(diào)2倍，提示IGF1R可能參與主動脈的氧化應激中，松齡血脈康可能通過調(diào)節(jié)IGF1R表達抗氧化應激、保護血管功能。

受體內(nèi)化不僅僅是結(jié)束受體及配體的活性態(tài)，同時是其調(diào)控下游效應器的調(diào)節(jié)信號。Martins等[11]研究發(fā)現(xiàn)CAV1參與尤文肉瘤細胞質(zhì)膜上IGF1受體內(nèi)化，對IGF1受體內(nèi)化有抑制作用，下游AKT和MAPK磷酸化也會受到抑制。Tang等[12]也發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞中，CAV1過表達能增加IGF1R表達從而激活PI3K/Akt及RAF/MEK/ERK通路?？梢奀AV1與IGF1R關系密切。但這些研究僅限于腫瘤實驗，在高血壓及氧化應激中CAV1是否影響IGF1R活性尚待深入。

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