骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠肺臟缺血再灌注損傷的影響

孫常榮 侯念果 李會 帥訓(xùn)軍 孫明潔 唐玉茹 徐堂文 艾登斌

[摘要]目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠肺臟缺血再灌注損傷的影響。方法 采用全骨髓培養(yǎng)法分離純化小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），結(jié)扎左側(cè)肺門60 min，再灌注240 min制備小鼠肺臟缺血再灌注損傷模型。70只小鼠隨機(jī)分為7組（n=10），包括：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、BMSCs 1組（尾靜脈注射1×106個BMSCs）、BMSCs 2組（尾靜脈注射2×106個BMSCs）、BMSCs 5組（尾靜脈注射5×106個BMSCs）、BMSCs 10組（尾靜脈注射10×106個BMSCs）、BMSCs it組（氣管內(nèi)注射5×106個BMSCs）。再灌注結(jié)束時抽取小鼠股動脈血，行血?dú)夥治?，并計算氧合指?shù)（PaO2/FiO2）。隨后處死小鼠，取肺組織，采用ELISA法檢測定肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量及髓過氧化物酶（MPO）的活性，光鏡下觀察肺組織損傷程度并進(jìn)行病理學(xué)評分。結(jié)果 與Sham組比較，I/R組、BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的PaO2/FiO2降低，肺組織病理學(xué)評分、MPO活性、IL-8、TNF-α含量升高，SOD活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與I/R組比較，BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的PaO2/FiO2升高，肺組織病理學(xué)評分、MPO、IL-8、TNF-α水平降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中BMSCs 10組最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），氣管內(nèi)注射與血管內(nèi)注射相同濃度BMSCs作用無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 BMSCs能夠明顯減輕肺組織缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)肺組織炎癥反應(yīng)有關(guān)，且具有明顯量效關(guān)系，氣管內(nèi)注射與血管內(nèi)注射相同濃度BMSCs作用無明顯區(qū)別。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肺；再灌注損傷；氧自由基

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）2（b）-0018-04

Influence of bone marrow mesenchymal stem cells on lung ischemia-reperfusion injury in mice

SUN Chang-rong1，2 HOU Nian-guo1 LI Hui1 SHUAI Xun-jun1 SUN Ming-jie1 TANG Yu-ru1 XU Tang-wen1，2 AI Deng-bin1▲

1.Department of Anesthesiology，Weifang Medical College，Shandong Province，Weifang 261053，China；2.Department of Anesthesiology，Research Center of Clinical Anesthesiology of Qingdao City，Qingdao Municipal Hospital，Shandong Province，Qingdao 266011，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on lung ischemia-reperfusion injury （LIRI） in mice.Methods BMSCs from rats were isolated，cultured and purified by the whole bone marrow acherence method.LIRI was produced by occlusion of the left hilum of lungs for 60 min followed by 240 min reperfusion.70 mice were randomly divided into 7 groups （n=10），included the sham operation group （the Sham group），the ischemia-reperfusion group （the I/R group），the BMSCs 1 group （tail vein injections of 1×106 BMSCs），the BMSCs 2 group （tail vein injections of 2×106 BMSCs），the BMSCs 5 group （tail vein injection of 5×106 BMSCs），the BMSCs 10 group （tail vein injection of 10×106 BMSCs），the BMSCs it group （endotracheal injection of 5×106 BMSCs）.At the end of reperfusion，blood samples were obtained for blood gas analysis and PaO2/FiO2 was calculated.Then，the animals were sacrificed and lung tissues were immediately removed for determination of superoxide dismutase （SOD），tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-8 （IL-8），and myeloperoxidase （MPO） and for microscopic examination of the pathological changes of lungs which were scored.Results Compared with Sham group，PaO2/FiO2 was significantly decreased，the pathological scores and the levels of TNF-α，IL-8，and MPO were increased，and SOD activity was decreased in I/R，BMSCs 1，BMSCs 2，BMSCs 5，BMSCs 10，BMSCs it group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with I/R group，PaO2/FiO2 was significantly increased，the pathological scores and the levels of TNF-α，IL-8，and MPO in lung tissues were decreased，and SOD activity was increased in BMSCs 1，BMSCs 2，BMSCs 5，BMSCs 10，BMSCs it group，the difference was statistically significant （P<0.05）.The most obvious group is BMSCs 10，the difference was statistically significant （P<0.05）.There is no obvious difference between endotracheal injection and intravascular injection with the same concentration of BMSCs，the difference was not statistically significant （P>0.05）.Conclusion BMCS can alleviate LIRI in mice，and the responsible mechanism is related to inhibition of inflammatory responses.The lung protective effect is dose dependent.There is no significant difference between endotracheal injection and intravascular injection with the same concentration of BMSCs.

[Key words]Bone marrow mesenchymal stem cells；Lung；Reperfusion injury；Oxygen free radical

肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）主要見于肺移植和體外循環(huán)手術(shù)的早期，是導(dǎo)致術(shù)后呼吸功能障礙及死亡的重要原因[1-2]，因此有必要探討其有效的防治措施。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化能力的干細(xì)胞，體外易于迅速擴(kuò)增，短期內(nèi)便能得到治療所需細(xì)胞量，可促進(jìn)損傷組織修復(fù)，是細(xì)胞替代治療的重要組成部分[3-4]。研究顯示，BMSCs對小鼠腎缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[5-6]，但其對LIRI的影響有待探討。本研究旨在探討B(tài)MSCs對小鼠LIRI的影響，現(xiàn)報道如下。

1對象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性C57BL/6J小鼠70只，購買于武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK（鄂）2015-0025]，6～8周齡，體重16～24 g。健康SD大鼠5只，購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2012-0001]，4周齡，體重98～105 g。實(shí)驗(yàn)過程中對實(shí)驗(yàn)動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要儀器和試劑

呼吸機(jī)：瑞世康醫(yī)療器械有限公司；低速高速離心機(jī)：上海安亭儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡：Olympus公司；M200酶標(biāo)儀：TECAN；流式細(xì)胞儀：北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒：南京建成科技有限公司；胎牛血清：美國gibco公司；高糖DMEM：美國gibco公司；雙抗：上海澤邁生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶：康為世紀(jì)生物有限公司；PBS緩沖液：美國gibco公司；

1.3實(shí)驗(yàn)分組和處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將小鼠分為7組（n=10），包括假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、BMSCs 1組（尾靜脈注射1×106個BMSCs）、BMSCs 2組（尾靜脈注射2×106個BMSCs）、BMSCs 5組（尾靜脈注射5×106個BMSCs）、BMSCs 10組（尾靜脈注射10×106個BMSCs）、BMSCs it組（氣管內(nèi)注射5×106個BMSCs）。

根據(jù)文獻(xiàn)[7]介紹的方法分離純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。大鼠脫臼處死后，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇全身浸泡消毒10 min。無菌條件分離雙下肢，磷酸鹽緩沖液清洗3次。將股骨和脛骨的骨骺端剪掉，暴露出骨髓腔，用添加青、鏈霉素的培養(yǎng)基沖出骨髓，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，重懸沉淀以1.0×109/L的細(xì)胞濃度接種于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h首次半量換液，48 h后全量更換培養(yǎng)基，以后每3天全量更換新鮮培養(yǎng)基。待貼壁細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時，用0.25%胰酶消化3～5 min，按1︰2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收獲第3代生長狀態(tài)良好骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物。

參照文獻(xiàn)[8]介紹的方法制備肺缺血再灌注損傷模型。小鼠腹腔注射0.1 mg/g氯胺酮+0.01 mg/g甲苯噻嗪進(jìn)行麻醉，氣管切開后，氣管插管機(jī)械通氣，潮氣量0.6 ml，通氣頻率120次/min，吸呼比1∶2，吸入氧濃度100%。左胸部去毛，消毒局部皮膚，鈍性分離第4、5肋間隙，充分暴露左側(cè)肺門，經(jīng)尾靜脈注射肝素5 U/g，5 min后用血管鉗于呼氣末阻斷左側(cè)肺門，使左肺缺血60 min即為缺血期，然后移除血管鉗解除阻斷，再灌注左肺240 min形成再灌注期。再灌注的同時，I/R組經(jīng)尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液0.5 ml，BMSCs 1組經(jīng)尾靜注射1×106個BMSCs，BMSCs 2組經(jīng)尾靜脈注射2×106個BMSCs，BMSCs 5組經(jīng)尾靜脈注5×106個BMSCs，BMSCs 10組經(jīng)尾靜脈注射10×106個BMSCs，BMSCs it組經(jīng)氣管內(nèi)注射5×106個BMSCs。實(shí)驗(yàn)過程中持續(xù)經(jīng)靜脈輸注生理鹽水450 μl/h，并維持直腸溫37～38℃，Sham組只開胸。于再灌注結(jié)束時抽取小鼠股動脈血，進(jìn)行血?dú)夥治?，并計算氧合指?shù)（PaO2/FiO2）。

1.4觀察指標(biāo)及檢測方法

放血處死小鼠，取左下肺組織，稱重后，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%組織勻漿，4℃離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）測定SOD、IL-8、TNF-α、MPO的含量。

取左下肺組織，10%甲醛溶液固定、常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察各組標(biāo)本組織學(xué)改變。在400倍視野下隨機(jī)選擇10個非重疊視野，參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行病理學(xué)損傷評分，取其平均值。1分：肺組織結(jié)構(gòu)正常；2分：肺間質(zhì)輕度充血和中性粒細(xì)胞輕度浸潤；3分：血管周圍水腫形成，肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞，中性粒細(xì)胞中度浸潤；4分：肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量中性粒細(xì)胞浸潤。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用多樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1七組小鼠PaO2/FiO2和肺組織病理學(xué)損傷評分的比較

與Sham組比較，I/R組、BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的PaO2/FiO2降低，肺組織病理學(xué)損傷評分升高（P<0.05）。與I/R組比較，BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的PaO2/FiO2升高，肺組織病理學(xué)損傷評分降低（P<0.05）。BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的上述指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2七組小鼠肺組織各測定指標(biāo)水平的比較

與Sham組比較，I/R組、BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的SOD降低，MPO、IL-8、TNF-α水平升高（P<0.05）。與I/R組比較，BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的SOD升高，MPO、IL-8、TNF-α降低（P<0.05）。BMSCs 1組、BMSCs 2組、BMSCs 5組、BMSCs 10組、BMSCs it組的上述指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

本研究參照文獻(xiàn)[8]介紹的方法采用夾閉小鼠左側(cè)肺門（包括氣管、肺動脈、肺靜脈）60 min，再灌240 min制備小鼠肺缺血再灌注損傷模型。結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組的PaO2/FiO2降低，光鏡下和電鏡下均可見病理改變，肺組織病理學(xué)損傷評分升高，提示模型制備成功。

參照文獻(xiàn)[7]介紹了全骨髓培養(yǎng)法分離純化小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本研究選擇在再灌注的同時，I/R組經(jīng)尾靜脈注射磷酸鹽緩沖液0.5 ml，BMSCs 1組經(jīng)尾靜注射1×106個BMSCs，BMSCs 2組經(jīng)尾靜脈注射2×106個BMSCs，BMSCs 5組經(jīng)尾靜脈注射5×106個BMSCs，BMSCs 10組經(jīng)尾靜脈注射10×106個BMSCs，BMSCs it組經(jīng)氣管內(nèi)注5×106個BMSCs。結(jié)果顯示，與I/R組比較，不同濃度BMSCs組的PaO2/FiO2升高，肺組織病理學(xué)損傷評分降低，且呈量效關(guān)系，提示注射BMSCs可減輕小鼠肺缺血再灌注損傷。

LIRI發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全闡明，目前研究認(rèn)為，可能與氧自由基引起的氧化損傷密切相關(guān)[10-12]。生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基的生成和清除處于動態(tài)平衡，但在LIRI時通過吞噬細(xì)胞系統(tǒng)、線粒體呼吸鏈等途徑釋放大量氧自由基。氧自由基是器官缺血再灌注后致組織損傷最早、最重要的有害物質(zhì)之一[13]。SOD為機(jī)體中清除自由基的酶，可清除氧自由基，其活性代表了組織抗氧化損傷的能力。本研究結(jié)果顯示，與I/R組比較，經(jīng)尾靜脈和氣管內(nèi)注射不同濃度BMSCs組的SOD水平升高，提示注射BMSCs可通過清除氧自由基，減輕小鼠肺缺血再灌注損傷。

中性粒細(xì)胞浸潤是導(dǎo)致LIRI的重要原因之一[14-17]?；罨闹行粤＜?xì)胞通過脫顆粒釋放MPO和其他蛋白水解酶及炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管膜損傷，發(fā)生滲透性肺水腫，出現(xiàn)肺彌散功能障礙[18]。通常情況下中性粒細(xì)胞是在炎癥介質(zhì)的趨化下遷移到肺組織中[19]。TNF-α及IL-8是中性粒細(xì)胞主要的趨化因子[20-21]。本研究結(jié)果顯示，與I/R組比較，經(jīng)尾靜脈和氣管內(nèi)注射不同濃度BMSCs組的MPO、TNF-α、IL-8的水平降低，提示注射BMSCs可通過抑制肺組織炎性反應(yīng)，減輕小鼠肺缺血再灌注損傷。

綜上所述，經(jīng)尾靜脈和氣管注射BMSCs可減輕小鼠肺缺血再灌注損傷，其機(jī)制與清除氧自由基和抑制肺組織的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Dong Y，Undyala VV，Gottlieb RA，et al.Review：autophagy：definition，molecular machinery，and potential role in myocardial ischemia-reperfusion injury[J].J Cardiovascular Pharmacol Therapeutics，2010，15（3）：220-230.

[2]de Perrot M，Liu M，Waddell TK，et al.Ischemia-reperfusion-induced lung injury[J].Am J Respir Crit Med，2003，167（4）：490-511.

[3]徐炎.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈注射移植對腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2007.

[4]張紅珊，方建培.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肺損傷研究進(jìn)展[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2011，10（5）：505-508.

[5]徐婷.3.0T MRI活體示蹤BMSCs移植修復(fù)腎臟缺血再灌注損傷[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2014.

[6]Hu H，Wang G.Bone marrow mesenchymal stem cell protect against renal ischemia reperfusion injury through paracrine mechanism[J].J Clin Rehabilitative Tissue Engineering Res，2011，15（32）：5995-5998.

[7]Zhuang S，Liu Y，Chen K，et al.Suitable conditions for the isolation purification and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro[J].J Clin Rehabilitative Tissue Engineering Res，2007，11（20）：3886-3891.

[8]Altemeier WA，Conrad LW，Ana VG，et al.Ischemia-reperfusion lung injury is attenuated in MyD88-deficient mice[J].PloS One，2013，8（10）：e77123.

[9]Kozian A，Schiling T，F(xiàn)reden F，et al.One-lung ventilation induces hyperperfusion and alveolar damage in the ventilated lung：an experimental study[J].Br J Anaesth，2008，100（4）：549-559.

[10]聶君，李勁松，王建軍，等.肺缺血再灌注損傷機(jī)制和防治進(jìn)展[J].國際移植與血液凈化，2007，5（3）：20-26.

[11]艾娜.TSP-1及其受體CD47在大鼠腎缺血再灌注損傷大鼠模型中的作用及機(jī)制初步探討[D].瀘州：瀘州醫(yī)學(xué)院，2014.

[12]蔣冠軍.Nesfatin-1預(yù)處理在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的研究[D].武漢：武漢大學(xué)，2016.

[13]Esme H，F(xiàn)idan H，Koken T，et al.Effect of lung ischemia-reperfusion on oxidative stress parameters of remote tissues[J].Eur J cardiothorac Surg，2006，29（3）：294-298.

[14]Den Hengest WA，Gielies JF，Lin JY，et al.Lung ischemia-reperfusion injury：a molecular and clinical view on a complex pathophysiological process[J].Am Physiol Heart Circ Physiol，2010，299（5）：H1283-H1299.

[15]Kotloff RM，Thabut G.Lung transplantation[J].Am J Respir Crit Med，2011，184（2）：159-171.

[16]張艷芳，王琦，楊廷桐.白介素-1、8、10與藥物干預(yù)對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006， 23（6）：572-574.

[17]張震宇，劉偉，楊衛(wèi)良，等.大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2007， 9（5）：452-455.

[18]段若望，李明星，宋炯，等.不同血液PH值對大鼠肺移植時缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2010，30（6）：685-687.

[19]Bosmann M，Ward PA.Protein-based therapies for acute lung injury：targeting neutrophil extracellular traps[J].Expert Opin Ther Targets，2014，18（6）：703-714.

[20]Maxey TS，Enelow R，Gaston B，et al.Tumor necrosis factor-alpha from resident lung cells is a key initiating factor in pulmonary ischemia-reperfusion injury[J].J Thorac Cardiovas Surg，2004，127（2）：541-547.

[21]李瑤，呂德官，陳臨溪，等.IL-8及其受體藥物與疾病的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報，2014，30（3）：310-313.

（收稿日期：2017-10-24 本文編輯：祁海文）