漸變低溫對不同規(guī)格菲律賓蛤仔斑馬蛤酶活性的影響

李杰， 孫溪蔓， 張鵬， 袁洪梅， 王曄， 閆喜武、2， 楊鳳、2

(1.大連海洋大學水產與生命學院，遼寧大連116023；2.遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，遼寧大連116023)

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum(以下簡稱蛤仔)，在遼寧俗稱蜆子，在山東俗稱蛤喇，在南方俗稱花蛤等，是廣泛生活于中國南北沿海的埋棲貝類，具有重要的經濟價值[1]。在中國北方，蛤仔養(yǎng)殖過程中要經歷冬季的低溫，甚至冰凍，鹽度為30～35的海水，冰點為 －1.9～－2℃。北方冬季近岸海水或者海水池塘的最低水溫通常低于－1℃，甚至更低[2－3]。而北方蛤仔養(yǎng)殖的苗種主要來自于南方 (主要是福建)，經高溫培育所得。這樣的苗種在北方潮間帶的低溫環(huán)境下無法安全越冬，致使大量的淺海灘涂被閑置。

蛤仔斑馬蛤 (以下簡稱斑馬蛤)是遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心通過選擇育種方法培育得到的抗逆性很強的蛤仔新品種。目前，關于斑馬蛤的研究主要集中在遺傳性狀[4－6]、養(yǎng)殖方式[7]和生態(tài)學[8－13]等方面。胥賢等[10]在研究低溫對蛤仔呼吸代謝影響時發(fā)現(xiàn)，溫度由7.6℃逐漸降低至－2.1℃，并且在冰水混合狀態(tài)下脅迫 7 d時，斑馬蛤存活率為93.3%，較普通蛤仔 (存活率為74.6%)有更強的耐低溫能力。生產試驗表明，斑馬蛤可以在北方水溫條件下安全越冬。了解斑馬蛤的耐低溫機制，對于該新品種的推廣和北方淺海灘涂的充分利用具有重要意義。

酶活性是常見的研究環(huán)境脅迫的生理生化機制的觀測指標。已有研究表明，餌料[14]、規(guī)格[15]、殼色[16]、家系[17]、溫度和 pH[18－20]等均對貝類的酶活性有影響。而溫度是影響酶活性的重要因素之一，關于溫度對貝類酶活性的影響研究絕大多數集中在粗酶液提取后反應溫度對酶活性的影響方面[18－23]，而關于外環(huán)境溫度脅迫對貝類酶活性影響的報道較少[24－28]，尤其是關于低溫對斑馬蛤酶活性影響的研究尚未見報道。為此，本試驗中模擬冬季低溫水平，進行了漸變低溫對斑馬蛤幼貝消化酶和抗氧化酶活性的影響研究，以期為探明斑馬蛤的耐低溫機制，以及完善和推廣斑馬蛤的養(yǎng)殖技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斑馬蛤幼貝由遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心人工繁育提供，其中大規(guī)格殼長為(17.08±0.7)mm、殼寬為 (11.2±0.84)mm，中規(guī)格殼長為 (13.12±0.72)mm、殼寬為 (8.8±0.41)mm，小規(guī)格殼長為 (7.67±0.71)mm、殼寬為 (5.72±0.54)mm。試驗前，幼貝在水溫為(14.4±0.2)℃的海水中暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每天全量更換海水1次，投喂螺旋藻粉2～3次。

暫養(yǎng)和試驗用水為大連市黑石礁近岸海域經過沉淀、過濾的新鮮海水，水質狀況符合 《GB 11607—1989漁業(yè)水質標準》的要求。

1.2 方法

1.2.1 漸變低溫的控制 試驗溫度設置為8(對照組)、5、2、0℃，實測為 (8.2±0.1)、 (5.4±0.1)、 (2.2±0.1)、 (0.2±0.1)℃。從暫養(yǎng)水溫(14℃)開始，以每3 d降低1℃的幅度逐漸降溫至設定的試驗溫度。具體方法為，首先在第一天降溫1℃，然后在此溫度下維持3 d后再進行降溫。在水溫降至8℃時，第一次取樣測定酶活性。由暫養(yǎng)水溫14℃降至6℃期間的降溫過程在控溫循環(huán)水族箱中進行，由6℃降至0℃期間的降溫在冰柜中進行。試驗期間每天換水一次并投餌，取樣前24 h只換水不投餌，使幼貝排空腸胃，避免腸道中食物對試驗結果的影響。

1.2.2 粗酶液的制備 隨機挑選一定數量的斑馬蛤，其中小規(guī)格斑馬蛤每組取8～10枚，中規(guī)格斑馬蛤每組取5～8枚，大規(guī)格斑馬蛤每組取3～5枚，每組設3個平行。在冰盤上用解剖刀將斑馬蛤的閉殼肌切斷，從中取出斑馬蛤的內臟組織，稱取質量，按質量與體積比為1 mg∶4 mL的比例加入預冷生理鹽水，用電動勻漿機 (10 000 r/min)在冰浴條件下勻漿3 min，勻漿液經離心機 (3500 r/min)離心10 min后，取上清液備用。

1.2.3 酶活性測定 對粗酶液上清液分別進行消化酶 (淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)酶活性的測定。使用南京建成科技有限公司試劑盒測定酶活性。其中，淀粉酶 (AMS)是組織中每毫克蛋白在37℃條件下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位 (U)；脂肪酶 (LPS)是在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物為1個酶活力單位 (U)；胃蛋白酶是在37℃條件下反應，每分鐘能催化水解血紅蛋白生成1 μmol酪氨酸的酶量為1個活力單位 (U)；過氧化氫酶 (CAT)是在37℃反應條件下，每毫克組織蛋白每秒鐘水解1 μmol的H2O2的量為1個活力單位 (U)；超氧化物歧化酶 (SOD)是在37℃反應條件下，每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD的量為1個活力單位 (U)。

1.3 數據處理

試驗數據均用平均值±標準差 (mean±S.D.)表示，用SPSS 20.0軟件進行雙因素方差分析，用Tukey方法進行多重比較。顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 低溫下斑馬蛤的死亡率

低溫對斑馬蛤酶活性影響試驗的死亡率結果見表1。溫度從5.4℃降至2.2℃時，死亡率較8.2℃降至5.4℃時略有增加，其后維持在較低水平；至試驗結束時，3種規(guī)格斑馬蛤的死亡率＜3%。

表1 低溫對斑馬蛤酶活性影響試驗的死亡率Tab.1 Mortality of zebra clam in the effects of low temperature on enzyme activity experiment %

2.2 低溫下斑馬蛤消化酶的變化

2.2.1 低溫對淀粉酶的影響 低溫對不同規(guī)格斑馬蛤內臟組織淀粉酶活性的影響結果見圖1。除殼長為13 mm的幼貝在溫度降至0.2℃時淀粉酶活性下降外 (但仍高于對照組)，隨著溫度下降，其他規(guī)格組幼貝平均淀粉酶活性基本呈直線升高趨勢。水溫為8.2、5.4、2.2、0.2℃時，3種殼長幼貝的平均淀粉酶活性依次為0.24、0.37、0.56、0.80 U/mg prot；8、13、17 mm幼貝在各溫度下的平均淀粉酶活性依次為0.51、0.41、0.55 U/mg prot。

雙因素方差分析表明，溫度、規(guī)格及二者的交互作用均對斑馬蛤淀粉酶活性影響極顯著 (P＜0.01)。多重比較結果表明:同一規(guī)格下，不同溫度組斑馬蛤淀粉酶活性有顯著性差異 (P＜0.05)，同一溫度下，不同規(guī)格的斑馬蛤淀粉酶活性有顯著性差異 (P＜0.05) (除2.2℃下13 mm與17 mm殼長組外)。

圖1 低溫對不同殼長斑馬蛤淀粉酶活力的影響Fig.1 Impact of low temperature on amylase activity in zebra clam with different shell length

2.2.2 低溫對胃蛋白酶和脂肪酶活性的影響 在8.2、5.4、2.2、0.2℃ 4個溫度下，不同規(guī)格斑馬蛤胃蛋白酶和脂肪酶活性均未檢出。

2.3 低溫下斑馬蛤抗氧化酶的變化

2.3.1 低溫對總超氧化物歧化酶 (SOD)酶活性的影響 低溫對不同規(guī)格斑馬蛤SOD活力的影響結果見圖2。隨著溫度的下降，SOD酶活性呈誘導－抑制的變化規(guī)律，總體呈誘導的趨勢，水溫為8.2、5.4、2.2、0.2℃時，3種殼長幼貝的平均SOD酶活性依次為 4.71、25.71、15.40、13.98 U/mg prot。但不同規(guī)格幼貝的SOD酶活性變化規(guī)律不同，13 mm和17 mm幼貝的SOD酶活性在5.4℃時顯著升高 (P＜0.05)，后維持在相對穩(wěn)定的水平；8 mm幼貝SOD酶活力在5.4℃時急劇升高 (P＜0.05)，后回落到較低水平。水溫為8.2℃時，8、13、17 mm幼貝的 SOD酶活性依次為9.77、2.39、1.95 U/mg prot，表現(xiàn)為規(guī)格越小酶活性越高；水溫降至0.2℃時，3種規(guī)格的斑馬蛤SOD酶活性依次9.15、12.52、20.27 U/mg prot，表現(xiàn)為規(guī)格越大酶活性越高。

雙因素方差分析表明，溫度、規(guī)格及二者的交互作用均對SOD酶活性影響極顯著 (P＜0.01)。多重比較結果表明:同一規(guī)格下，低溫試驗組SOD活性均顯著高于對照組 (P＜0.05)，同時5.4℃組幼貝的酶活性顯著高于2.2℃組 (P＜0.05)，其中8 mm殼長組是2.2℃組的2.3倍，而2.2℃和0.2℃組間無顯著性差異 (P＞0.05)；8.2、5.4、2.2℃溫度下，8 mm殼長組的SOD酶活性均顯著高于13 mm和17 mm殼長組 (P＜0.05)，而13 mm和17 mm殼長組間則無顯著性差異 (P＞0.05)，溫度降至0.2℃時，SOD酶活性由小到大依次為殼長8 mm＜殼長13 mm＜殼長17 mm，并且組間有顯著性差異 (P＜0.05)。

圖2 低溫對不同殼長斑馬蛤SOD活力的影響Fig.2 Impact of low temperature on SOD activity in zebra clam with different shell length

2.3.2 低溫對過氧化氫酶 (CAT)酶活性的影響

從圖3可見:隨著溫度的下降，CAT酶活性總體呈下降趨勢；殼長為8 mm的斑馬蛤酶活性在溫度降至5.4℃時急劇下降 (P＜0.05)，并在隨后的降溫過程中一直維持在較低的水平；而殼長為13 mm和17 mm的斑馬蛤在溫度降至2.2℃時酶活性才急劇下降 (P＜0.05)。水溫為 8.2、5.4、2.2、0.2℃時，3種殼長幼貝的平均CAT酶活性依次為17.2、 5.45、 0.70、 1.74 U/mg prot。 8.2 ℃ 時，8、13、17 mm幼貝的CAT酶活性依次為36.81、5.22、9.56 U/mg prot，溫度降至0.2℃時，依次降為 2.55、 2.49、 0.17 U/mg prot。

雙因素方差分析表明，溫度、規(guī)格及二者的交互作用均對CAT酶活性影響極顯著 (P＜0.01)。多重比較結果表明:殼長為8 mm和17 mm時，3個低溫試驗組 (5.4、2.2、0.2℃)的酶活性顯著低于對照組 (P＜0.05)，并且這3個低溫試驗組間也有顯著性差異 (P＜0.05)；殼長為13 mm時，5.4℃組酶活性顯著高于其他溫度組 (P＜0.05)。8.2℃時，8 mm殼長組CAT酶活性顯著高于13 mm和17 mm殼長組 (P＜0.05)，8 mm殼長組酶活性分別為13、17 mm殼長組的7.1、3.8倍；5.4℃時，8 mm殼長組酶活性顯著低于13 mm和17 mm殼長組 (P＜0.05)；溫度降至0.2℃時，8 mm和13 mm殼長組CAT酶活性顯著高于17 mm殼長組 (P＜0.05)。

圖3 低溫對不同規(guī)格斑馬蛤CAT活力的影響Fig.3 Impact of low temperature on CAT activity inzebra clam with different shell length

3 討論

3.1 低溫對斑馬蛤幼貝消化酶活性的影響

錢佳慧等[24]發(fā)現(xiàn)，溫度為19～31℃條件下(漸變)，25.6℃時華貴櫛孔扇貝Chlamys nobilis幼貝軟體部的淀粉酶活力達最大值。劉敏[25]對施氏獺蛤Lutraria sieboldii的研究表明，在水溫為12、17、22、27、32℃條件下，脅迫處理 (突變)64 h，各組施氏獺蛤肝胰臟和鰓組織淀粉酶活性在一定范圍內隨著溫度升高而增強，峰值出現(xiàn)在27℃或32℃，低溫 (12℃)對淀粉酶活性有較顯著的抑制作用。朱曉聞[26]研究表明，在18～34℃范圍內，溫度為28.06℃時馬氏珠母貝淀粉酶活力最高。上述試驗表明，在較高溫度范圍內 (＞12℃)，溫度無論突變還是漸變，貝類淀粉酶活性均隨著溫度的下降而降低。

本試驗結果與大多數文獻結論相反，在8.2℃到0.2℃范圍內，隨著水溫逐漸下降，淀粉酶活力逐漸升高 (圖1)。蛤仔適宜的生存溫度為5～35℃[1]，本試驗所設定的溫度超出了蛤仔適宜的生存溫度，這可能是導致本試驗結果與大多數試驗結果不同的主要原因。本試驗中，隨著水溫的降低淀粉酶活性升高，可能是對低溫脅迫的一種積極的應激反應，其具體機制還有待進一步研究。張永譜等[27]研究了不同年齡泥蚶Tegillarca granosa幾種消化酶活性的季節(jié)變化，發(fā)現(xiàn)淀粉酶的活力依次為冬季＞秋季＞春季和夏季，與本試驗結果吻合。倪小英等[28]發(fā)現(xiàn)，小莢蟶Siliqua minima淀粉酶活性的季節(jié)變化為秋季最高、夏季最低，與本試驗結果不同。說明不同物種的淀粉酶活性對溫度的響應具有特異性，同時也與不同試驗的餌料組成不同及貝類發(fā)育階段的食性不同等有關。

本試驗中，隨著溫度的降低，較小規(guī)格 (8 mm)斑馬蛤淀粉酶活力升高最快，溫度為8.4℃時其淀粉酶活性較其他兩種規(guī)格都低，但當溫度降至0.2℃時，其淀粉酶活性最高 (圖1)。說明小規(guī)格斑馬蛤對低溫脅迫更敏感。本試驗中各個溫度條件下均未檢測到蛋白酶和脂肪酶?？赡芘c蛤仔的食性、試驗期間投喂的餌料 (螺旋藻粉)和過低的水溫導致脂肪酶和蛋白酶分泌量很低有關。楊元昊等[29]在對蘭州鲇Silurus lanzhouensis消化酶研究時發(fā)現(xiàn)，在低于20℃或高于30℃條件下，蘭州鲇除后腸外，胃、肝胰臟及前、中腸中的脂肪酶活性均無法檢出。

3.2 低溫對斑馬蛤幼貝抗氧化酶活性的影響

3.2.1 低溫對斑馬蛤幼貝SOD酶活性的影響SOD是一種具有多種異構體的還原酶，是抗氧化系統(tǒng)中最先起反應的酶。它能夠直接作用于超氧陰離子(O2－·)，并與超氧陰離子發(fā)生歧化反應，生產危害較低的過氧化氫以及分子氧，減輕自由基對機體的損害[30]。本研究表明，在較低的溫度范圍內 (8.2～0.2℃)，水溫持續(xù)下降，SOD酶活性呈升高 (5.4℃時)－下降或相對穩(wěn)定 (2.2℃時)的變化趨勢，總體水平較對照組高。說明低溫對SOD酶活性有誘導作用 (圖 2)。溫度為 0.2、2.2、5.4℃時的平均SOD酶活性為8.2℃時的2.8、5.6和7.6倍。表現(xiàn)為低溫條件下，溫度越高誘導作用就越明顯。

孔祥會等[31]研究表明，與溫度為27℃時相比，鋸緣青蟹Scylla serrata Forskal的SOD活性在5℃和10℃馴化下顯著高于對照組 (27℃)，此結果與本試驗結果吻合。時少坤[32]對雜交鮑Haliotis discus hannai Ino研究表明，水溫由18℃經12℃降至6℃時，SOD酶活性與對照組無顯著性差異。王天神等[33]研究表明，在水溫為10～30℃條件下，克氏原螯蝦Procambarus clarkii SOD活性隨著溫度升高而增強。不同研究者所得規(guī)律不同，其原因可能與物種的不同、物種發(fā)育階段的不同、對照組溫度的高低、試驗設定的溫度范圍、降溫方式及脅迫時間等不同有關。如，周鮮嬌等[34]對凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei的試驗結果表明，水溫從28℃降至18℃ (A組)和14℃ (B組)時，降溫后1 h內，對蝦肝胰腺中SOD活性迅速上升，之后則逐漸下降。劉偉等[35]對刺參的研究表明，緩降模式下體腔液中 SOD活力均呈先升高后降低再升高的變化趨勢，而驟降模式下SOD活力則呈先升高后降低的變化趨勢。

本試驗中，除了降溫過程中蛤仔酶活性的平均值為殼長8 mm＜殼長13 mm＜殼長17 mm以外，3種規(guī)格幼貝SOD酶活性對降溫的響應也不相同(圖2)。水溫由8.2℃降到5.4℃時，3種規(guī)格幼貝均較對照組 (8.2℃)顯著升高，但是殼長8 mm幼貝的SOD活力比13、17 mm幼貝升高的幅度最大，隨后急劇下降，至0.2℃時，其酶活性為對照組的93%；而殼長13 mm和17 mm幼貝在5.4℃酶活性顯著升高后，隨著水溫的下降酶活性始終維持在較高水平，溫度降至0.2℃時酶活性分別為對照組的5.2倍和10.4倍。說明規(guī)格越大，通過提高SOD酶活性來抵御低溫脅迫的能力就越強。3.2.2 低溫對斑馬蛤幼貝CAT酶活性的影響CAT與SOD具有協(xié)同作用，可將SOD酶催化生成的過氧化氫催化生成氧氣和水，以消除超氧陰離子等的中間產物對細胞的毒害，并且增強吞噬細胞的防御能力和機體免疫功能[13]。本試驗表明，水溫從8.2℃降至5.4℃時，8 mm的斑馬蛤酶活力下降的幅度最大，而13 mm和17 mm的斑馬蛤在水溫降至2.2℃時酶活力才急劇下降 (圖3)。說明低溫對CAT有抑制作用，并且對小規(guī)格幼貝 (殼長為8 mm)的抑制作用強于較大規(guī)格幼貝 (殼長為13 mm和17 mm)。水溫降至0.2℃時，殼長為8 mm和13 mm幼貝的CAT活性略有回升，顯示與SOD協(xié)同作用來抵御低溫脅迫的不良刺激。

受試驗條件和物種的影響，不同的研究者所得低溫對CAT的影響結果也不同。時少坤[32]對雜交鮑的研究結果顯示，水溫由18℃經12℃降至6℃時，CAT酶活性與對照組無顯著性差異。周鮮嬌等[34]對凡納濱對蝦的研究結果表明，水溫從28℃降至18℃和14℃，降溫后1 h內對蝦肝胰腺中CAT活性上升，而后下降，其中14℃時CAT活性下降的趨勢比18℃時更加迅速、明顯。劉偉等[35]對刺參的研究表明，緩降模式下CAT活力呈先降低后升高的變化趨勢，驟降模式下CAT活力呈先升高后降低的變化趨勢。王天神等[33]研究表明，在10～30℃水溫范圍內，克氏原螯蝦的CAT活性隨著溫度的升高呈下降趨勢。孔祥會等[31]研究表明，與27℃相比，鋸緣青蟹CAT活性在5、10、15℃3個馴化溫度下均顯著升高，此結果與本試驗中CAT酶活性的變化規(guī)律相反。

綜上，以每天1℃并維持3 d的幅度漸變降溫條件下，斑馬蛤幼貝主要通過提高淀粉酶和SOD酶活性來抵御低溫帶來的惡劣環(huán)境和氧化損傷，較小規(guī)格幼貝 (8 mm和13 mm)在接近0℃時CAT有微弱的協(xié)同作用，總體上較大規(guī)格幼貝的抗低溫能力較強。所得試驗結論可為弄清蛤仔斑馬蛤越冬生理機制及大規(guī)模生產推廣提供一定參考。

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