鯉HSP90作為錦鯉皰疹病毒核酸疫苗免疫佐劑的效果研究

金曄，袁海延，王好，周井祥，劉艷輝，李改娟，祖岫杰

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長春130033)

錦鯉皰疹病毒病 (Koi Herpesvirus Diease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒 (Koi Herpesvirus，KHV)引起的一種高致病性和高死亡率的病毒性疾病，死亡率高達(dá)80%。KHVD是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (OIE)必報(bào)疾病之一[1]，給中國及世界多個(gè)國家鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，沒有可供使用的特效藥物來治療該種疾病，接種疫苗一直被認(rèn)為是有效的治療病毒性疾病的手段，但免疫效果一直未能達(dá)到良好的目標(biāo)效果[2]。

熱休克蛋白 (Heat shock protein，HSP)是細(xì)胞或生物體在各種不利條件 (包括缺氧、鹽度、重金屬、自由基、病毒感染)刺激下產(chǎn)生的與抗逆性相關(guān)的一類應(yīng)激蛋白[3－5]。根據(jù)分子量和等電點(diǎn)的不同，劃分為七大家族:小 HSP、HSP40、HSP60、 HSP70、 HSP90、 HSP110和泛素[6]。 在免疫過程中，熱休克蛋白可以作為佐劑、抗原、抗原載體，能提高專一性免疫效果[7]。研究人員通過構(gòu)建重組HSP－肽段復(fù)合體進(jìn)行抗腫瘤免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HSP既具有增強(qiáng)免疫的功能，又具有免疫佐劑的一系列特征；在抗原呈遞中通過HSP將內(nèi)源性和外源性抗原呈遞給MHCⅠ分子，專一啟動(dòng)CD8＋T 細(xì)胞， 激活 CTLs免疫應(yīng)答[8－11]。

與其他HSP家族相比，HSP90家族含量豐富，具有非常高的保守性[12]。HSP90可與細(xì)胞中多種不同功能的蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[13]。當(dāng)受到有害物質(zhì)脅迫時(shí)，HSP90表達(dá)水平提高，產(chǎn)生熱耐受作為分子伴侶來幫助細(xì)胞，維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)[14－15]。近年來，HSP所具有的免疫增強(qiáng)作用在核酸疫苗中應(yīng)用廣泛。焦鳳平等[14]將重組質(zhì)粒 PC－P6－gBCTL－HSP70與單純皰疹病毒Ⅱ型 (HSV－2)疫苗聯(lián)合免疫發(fā)現(xiàn)，其具有同時(shí)增強(qiáng)體液免疫與細(xì)胞免疫的功能；李淑君[15]研究發(fā)現(xiàn)，加入佐劑HSP65后與DNA質(zhì)粒聯(lián)合，比單一滅活苗或單一DNA質(zhì)粒誘導(dǎo)細(xì)胞免疫水平均高；Bolhassani等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HSPgp96作為佐劑與人體乳頭瘤E7(HPV E7蛋白)聯(lián)合免疫顯示，其具有特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，加入相關(guān)熱休克蛋白佐劑以提高核酸疫苗免疫效果是必不可少的。

目前，HSP90在作為水產(chǎn)動(dòng)物免疫佐劑方面的應(yīng)用還不常見。本研究中通過構(gòu)建pEGFP－C1－HSP90真核表達(dá)載體，探究pEGFP－C1－HSP90作為免疫佐劑與pIRES－ORF81核酸疫苗 (吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基于KHV主要保護(hù)性抗原囊膜蛋白ORF81研制的KHV核酸疫苗，保護(hù)率達(dá)80%以上，專利號(hào)為CN102988973A)[17－19]聯(lián)合免疫的免疫效果，旨在為錦鯉皰疹病毒病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚 試驗(yàn)魚購自長春市某養(yǎng)魚場，選取體質(zhì)量為200～300 g的健康鯉150尾，在實(shí)驗(yàn)室25℃水族箱中飼養(yǎng)2周以上。

1.1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞、病毒重組 質(zhì)粒 pIRESORF81、KHV陽性血清和鯉腦細(xì)胞 (CCB)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院保存和凍存[20]。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 DNA Marker(DL2000、DL5000)及反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶均為TaKaRa產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒、卡那霉素、氨芐青霉素購自AxyGen公司；焦磷酸二乙酯(DEPC)購自北京鼎國公司；EndoFectin TM－Max轉(zhuǎn)染試劑購自長春維爾特科技有限公司；抗鯉IgM單克隆抗體購自AQUATIC Diagnostic Ltd；羊抗鼠酶標(biāo)二抗購自三箭生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)別。

1.2 方法

1.2.1 HSP90基因的引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Gen-Bank上登錄的鯉 HSP90基因序列 (登錄號(hào):L513382.1)，使用Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上、下游引物分別為

其中畫線部分依次引入XhoⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

1.2.2 HSP90基因的克隆與鑒定 將健康試驗(yàn)鯉用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒，在超凈工作臺(tái)上解剖魚體，取其頭腎組織。采用TRizol(Invitrogen)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，建立100 μL反轉(zhuǎn)錄體系。PCR反應(yīng)程序:95℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，63.5℃下退火30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；在72℃下延伸1 min，于4℃下保存，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

將回收純化的HSP90目的基因連接至pMD－19T克隆載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定均為陽性的重組克隆質(zhì)粒保種，由生工生物工程 (上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank登陸的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.3 pEGFP－C1－HSP90重組質(zhì)粒的構(gòu)建回收

用T4DNA連接酶將pMD19－T－HSP9目的基因與pEGFP－C1酶切回收的大片段連接后，轉(zhuǎn)入至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，用含有卡那霉素液體的LB培養(yǎng)基進(jìn)行篩選后，經(jīng)PCR和雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證。選取陽性質(zhì)粒命名為pEGFP－C1－HSP90并由生工生物工程 (上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 重組質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90的細(xì)胞表達(dá)將純化重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90及pIRESORF81菌液劃線培養(yǎng)。挑取單一乳白色菌落接種到液體LB培養(yǎng)基 (Kan抗性)中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后進(jìn)行擴(kuò)搖，收集菌體進(jìn)行重組質(zhì)粒的大量提取。使用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)測定重組表達(dá)質(zhì)粒在260 nm波長時(shí)的吸光值，并計(jì)算重組表達(dá)質(zhì)粒濃度 (μg/μL)，其計(jì)算公式為

用L－15培養(yǎng)基分別稀釋重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90和轉(zhuǎn)染試劑 EndoFectionTM Max，并置于室溫。用125 μL L－15培養(yǎng)基分別稀釋重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP－C1－HSP90(2.5 μg) 和不同劑量 (5.0、7.5、10.0 μg) 的轉(zhuǎn)染試劑EndoFectionTM Max，并將兩者充分混勻，靜置10～20 min，形成DNA－EndoFectionTM混合物，并將混合物逐滴加入到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中，在26℃培養(yǎng)箱中孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況并采集圖片。

1.2.5 重組質(zhì)粒 pEGFP－C1－HSP90與 pIRESORF81聯(lián)合免疫 隨機(jī)選取10尾鯉頭腎組織樣品進(jìn)行PCR檢測，鑒定結(jié)果顯示均未感染KHV。將試驗(yàn)魚平均分為6組，每組10尾，將表1試劑按組分配，每組配制成2000 μL，給每尾鯉肌肉注射，劑量均為200 μL。每周免疫1次，共免疫3次。

1.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90誘導(dǎo)鯉的免疫效果檢測 采用尾靜脈取血方法，免疫前采血一次，共進(jìn)行3次免疫，第一次和第二次免疫一周后采血一次，第三次免疫后第一周、第二周、第三周分別采血一次。制備血清后進(jìn)行間接ELISA檢測，結(jié)果通過酶標(biāo)儀OD450nm測定。

表1 鯉免疫分組及注射量Tab.1 Immune groups and injection volumes in common carp

2 結(jié)果與分析

2.1 HSP90基因的PCR擴(kuò)增

將鯉頭腎組織所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA模板，以HSP90－F1、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得與預(yù)期片段大小相符的687 bp基因，結(jié)果如圖1所示。

圖1 鯉HSP90基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR amplification product of HSP90 in common carp

2.2 克隆質(zhì)粒pMD19－T－HSP90的雙酶切鑒定

使用XhoⅠ和EcoRⅠ兩種內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pMD19－T－HSP90進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，符合預(yù)期結(jié)果大小，在687 bp處有明顯條帶 (圖2)，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19－T－HSP90。

2.3 測序結(jié)果的BLAST比對(duì)

將HSP90的測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果見圖3，所克隆的HSP90基因與GenBank中登入的鯉HSP90基因序列匹配度相同。

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90的雙酶切鑒定

將重組質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果顯示，在687 bp處有明顯條帶，另一條帶在5000 bp左右 (圖4)，與預(yù)期結(jié)果相符。表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90。

圖 2 pMD19－T－HSP90的雙酶切Fig.2 Identification of double restriction enzyme digestion for pMD19－T－HSP90

2.5 重組質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90的細(xì)胞表達(dá)

2.5.1 重組表達(dá)質(zhì)粒濃度 根據(jù)濃度公式計(jì)算出pEGFP－C1－HSP90、 pIRES－ORF81 重組表達(dá)質(zhì)粒的濃度分別為 0.95、 0.63 μg/μL。

2.5.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將重組質(zhì)粒pEGFPC1－HSP90(2.5 μg) 分別與3種不同劑量 (5.0、7.5、 10.0 μg) 的轉(zhuǎn)染試劑 EndoFectionTM Max混合后轉(zhuǎn)染至鯉腦細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并成像。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染試劑EndoFectionTM Max劑量為5.0 μg時(shí)轉(zhuǎn)染效果最佳，重組質(zhì)粒在鯉腦細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染熒光圖見圖5。

2.6 對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的PCR檢測

隨機(jī)選取10尾試驗(yàn)鯉，對(duì)其頭腎組織樣品基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以KHV病毒作為陽性對(duì)照。結(jié)果顯示，所選10尾試驗(yàn)鯉均為KHV陰性 (圖6)，未攜帶KHV病毒，可以進(jìn)行免疫試驗(yàn)。

2.7 抗體水平ELISA檢測

圖3 鯉HSP90基因的BLAST比對(duì)Fig.3 The BLAST contrast of HSP90 gene in common carp

圖4 pEGFP－C1－HSP90的雙酶切鑒定Fig.4 The PCR identification of recombinant plasmid pEGFP－C1－HSP90

圖5 pEGFP－C1－HSP90在鯉腦細(xì)胞中的表達(dá) (5 μg)Fig.5 Expression in common carp brain(CCB)cells of pEGFP－C1－HSP90(5 μg)

通過間接ELISA方法檢測抗體水平，在450 nm處吸光值平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算結(jié)果如表2所示。從表2可見，空白對(duì)照組與PBS對(duì)照組均沒有特異性抗體產(chǎn)生，而重組質(zhì)粒單獨(dú)免疫或聯(lián)合免疫均可以獲得較高的抗體水平，免疫次數(shù)增加的同時(shí)抗體水平也隨之增加。與單獨(dú)用pIRES－ORF81核酸免疫相比，pEGFP－C1－HSP90作為佐劑聯(lián)合免疫抗體水平相對(duì)升高，其中第6組即pIRESORF81(10 μg) ＋pEGFP－C1－HSP90(20 μg) 在各免疫劑量組中相對(duì)較好，第三次免疫后兩周，抗體水平達(dá)到最高 (1.316 9)，但與其他組無顯著性差異 (P＞0.05)。后續(xù)為驗(yàn)證重組質(zhì)粒的安全性，在結(jié)束試驗(yàn)后對(duì)試驗(yàn)魚暫養(yǎng)一個(gè)月，未發(fā)現(xiàn)對(duì)魚體健康存在不良影響，并隨機(jī)篩選部分試驗(yàn)魚進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察，也未發(fā)現(xiàn)異常。

表2 ELISA檢測抗體水平 (OD450 nm)Tab.2 Antibody detection(OD450 nm)by ELISA

圖6 試驗(yàn)鯉的PCR檢測Fig.6 The PCR detections of the test common carp

3 討論

3.1 KHV相關(guān)疫苗研制情況

自20世紀(jì)90年代末首次對(duì)KHV的描述以來，這種病毒已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行，對(duì)鯉和錦鯉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展造成極大危害。KHV也通過影響野生鯉種群進(jìn)而對(duì)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響，其作為水生動(dòng)物疫病病毒越來越被重視。但現(xiàn)有開發(fā)的核酸疫苗都或多或少存在一些問題。其中，弱毒苗雖然免疫效果較好[21－22]，但存在散毒和返強(qiáng)的危險(xiǎn)，后經(jīng)Yasumoto等[23]研發(fā)的用質(zhì)體脂包裹甲醛滅活的KHV滅活疫苗與弱毒疫苗相比，具有安全性好、不存在散布病毒和造成KHV新疫源的危險(xiǎn)，但其產(chǎn)生的保護(hù)力不強(qiáng)，僅為65%，需要反復(fù)多次免疫，一直未能達(dá)到預(yù)期效果。因此，為了增強(qiáng)核酸疫苗的免疫原性，加入如佐劑的免疫刺激劑尤為重要。

3.2 HSP90免疫佐劑研究情況

相關(guān)學(xué)者研究表明，病毒HSP90高度保守，在生物體內(nèi)發(fā)揮極其重要的功能。王婷婷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，菱鲆Psetta maxima胚胎細(xì)胞系在感染鰻弧菌Vibrio anguillarum 6 h后，HSP90β即可被檢測到且顯著上調(diào)；馮儷等[25]通過構(gòu)建 PVAXHSP90重組質(zhì)粒聯(lián)合核酸疫苗顯示出良好的免疫保護(hù)作用，都具有良好的免疫應(yīng)答和抗原呈遞作用。

本試驗(yàn)中，為增強(qiáng)pIRES－ORF81核酸疫苗的免疫活性，選擇 HSP90作為 KHV pIRES－ORF81疫苗的佐劑。用 pIRES－ORF81與重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP－C1－HSP90聯(lián)合免疫患病鯉，采集鯉血清，通過間接ELISA檢測抗體水平。研究結(jié)果表明，重組質(zhì)粒單獨(dú)免疫或聯(lián)合免疫均可以獲得較高的抗體水平，與單獨(dú)用pIRES－ORF81核酸免疫效果相比， pEGFP－C1－HSP90與 pIRES－ORF81聯(lián)合免疫后抗體水平相對(duì)升高。可以看出，HSP90可以提高專一性免疫效果，重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP－C1－HSP90對(duì)pIRES－ORF81的抗體水平起到了促進(jìn)作用，與上述學(xué)者的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果可為后續(xù)水生動(dòng)物熱休克蛋白研究提供參考數(shù)據(jù)，還可為錦鯉皰疹病毒病的疫苗研制及用免疫佐劑聯(lián)合免疫治療提供新的思路。

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