海水青鳉雌激素受體基因的克隆、組織表達(dá)特性及環(huán)境雌激素EE2對(duì)其表達(dá)的影響

張民， 安哲， 彭會(huì)、2

(1.近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361102；2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門361102)

內(nèi)分泌干擾物在環(huán)境中分布廣泛，可以影響激素調(diào)節(jié)的生理進(jìn)程以及野生動(dòng)物和人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)及其生殖系統(tǒng)的功能[1]。內(nèi)分泌干擾物通過(guò)模擬或阻斷內(nèi)源性激素的活動(dòng)，改變內(nèi)源性激素的新陳代謝或與內(nèi)源性激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)的激素受體而發(fā)揮毒害作用[2]。17α－炔雌醇 (17α－ethinylestradiol，EE2)是口服避孕藥的主要活性成分[3]，已經(jīng)作為一種具有雌激素效應(yīng)的典型內(nèi)分泌干擾物而被廣泛研究。已有研究顯示，雌激素是通過(guò)其特異性的雌激素受體介導(dǎo)而發(fā)揮作用[4－7]。雌激素受體作為核受體超家族一員，其結(jié)構(gòu)包括A～F 6個(gè)功能域[8]。N端的A/B結(jié)構(gòu)域包含非配體依賴性激活結(jié)構(gòu)域 (AF－1)，參與調(diào)控雌激素和雌激素受體的結(jié)合。C區(qū)是一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNA binding domain，DBD)，主要負(fù)責(zé)DNA的結(jié)合，其序列在不同物種間高度保守。緊接著DBD的D區(qū)是一個(gè)鉸鏈功能域，核定位信號(hào) (nuclear localization signals，NLS)通常位于此區(qū)域。C端的E/F區(qū)域包括 E區(qū)配體結(jié)合域 (ligand binding domain，LBD)和F區(qū)[9]。LBD結(jié)構(gòu)域含有第二個(gè)轉(zhuǎn)錄激活功能域 (AF－2)，它的轉(zhuǎn)錄激活是配體依賴性的。F結(jié)構(gòu)域的具體功能還未闡明。

雌激素受體 (estrogen receptor，ER)首先在大鼠Ratttus norvegicus子宮中被發(fā)現(xiàn)[10]，隨后從無(wú)脊椎動(dòng)物如牡蠣Crassostrea gigas[11]到哺乳動(dòng)物如人類Homo sapiens[12－13]的多種物種中被鑒定得到。哺乳動(dòng)物存在2個(gè)雌激素受體基因ERα和ERβ，如小鼠Mus musculus[14]。硬骨魚中存在至少3個(gè)不同雌激素受體亞型基因，如在大西洋石首魚Micropogonias undulatus[15]、日本青鳉 Oryzias latipes[16]、斑馬魚 Danio rerio[17]、大口鱸 Micropterus salmoides[18]、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus[19]和大黃魚 Larimichthys crocea[20]中存在 ERα1/β1/β2 3 個(gè)雌激素受體，而在金魚 Carassius auratus[21]和虹鱒Oncorhynchus mykiss[22]中存在 ERα1/α2/β1/β2 4 個(gè)雌激素受體基因。研究顯示，ERα和ERβ基因在多種組織中均有表達(dá)，在肝臟和性腺中高表達(dá)[21，23]，但它們?cè)诓煌~類中的表達(dá)模式不相同。這表明，不同魚類中含有多個(gè)雌激素受體亞型基因，但其精確功能尚未闡明。已有報(bào)道顯示，環(huán)境雌激素可不同程度地影響雌激素受體各亞型基因的表達(dá)。例如，EE2暴露顯著誘導(dǎo)日本青鳉Oryzias latipes肝臟ERα基因表達(dá)，且呈劑量依賴效應(yīng)[24]；環(huán)境劑量EE2顯著誘導(dǎo)雄性蝦虎魚Pomatoschistus minutus肝臟 ERα/β 基因表達(dá)[25]。 17β－雌二醇(17β－estradiol，E2)顯著誘導(dǎo)虹鱒肝臟ERα基因的表達(dá)[26]；石油廢水和E2暴露，可以對(duì)大西洋鱈Gadus morhua胚胎和仔魚產(chǎn)生高死亡率，但是對(duì)變態(tài)后幼魚卻未見明顯影響[27]。這些都說(shuō)明，不同魚類以及同一種魚類的不同生命周期對(duì)環(huán)境雌激素的敏感度不同，不同雌激素受體基因?qū)Νh(huán)境雌激素的響應(yīng)也不盡相同。卵黃蛋白原 (vitellogenin，vtg)基因通常被用作內(nèi)分泌干擾的分子標(biāo)志物。在卵生脊椎動(dòng)物中，卵黃蛋白原在肝臟中產(chǎn)生，然后通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)铰殉瞇28]。已有研究顯示，vtg基因的表達(dá)受到環(huán)境雌激素的顯著影響。例如，EE2暴露下日本青鳉顯著誘導(dǎo)肝臟vtg1基因表達(dá)[24]，同樣可以顯著誘導(dǎo)虹鱒肝臟vtg1基因表達(dá)[26]。

海水青鳉Oryzias melastigma是一種潛在的海洋模式魚類，正逐漸被廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究[29－30]。海水青鳉與日本青鳉基因背景相近，很多研究資料可以參考淡水青鳉加以利用[31]。本研究中利用海水青鳉作為一種生態(tài)毒理學(xué)模型，克隆獲得海水青鳉雌激素受體3個(gè)亞型基因OM－ERα/β1/β2的cDNA序列，并預(yù)測(cè)分析了其結(jié)構(gòu)特性和進(jìn)化特征，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析其在多個(gè)組織中及多個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，并觀察不同劑量的環(huán)境雌激素EE2水體暴露對(duì)海水青鳉仔魚雌激素受體基因的表達(dá)調(diào)控，旨在為進(jìn)一步開展與海水青鳉內(nèi)分泌干擾相關(guān)的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用海水青鳉由香港城市大學(xué)贈(zèng)予，廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已建立一套完全自主循環(huán)的海水養(yǎng)殖系統(tǒng)，用于飼養(yǎng)海水青鳉，穩(wěn)定繁殖7年。養(yǎng)殖條件為:室溫 (25±2)℃，人工海水鹽度為32±1，海水溶解氧含量為 (6.5±0.2)mg/L，晝夜光照比為14∶10。

將17α－炔雌醇 (EE2)(Sigma－Aldrich) 溶于DMSO中，母液濃度為10 mg/L，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集 海水青鳉的胚胎發(fā)育和個(gè)體發(fā)育與淡水青鳉Oryzias latipes相似[32]。選取胚胎發(fā)育的2個(gè)時(shí)間點(diǎn) (4、8 dpf)及個(gè)體發(fā)育的5個(gè)時(shí)間點(diǎn) (1、4、8、16、30 dph)作為檢測(cè)靶點(diǎn)。其中:4 dpf(dpf＝days post fertilization)為受精后第4天，是鰓血管形成期；8 dpf，肝臟發(fā)育完全；1 dph(dph＝days post hatching)，為孵化后的第一天。

選取性成熟的親本魚，根據(jù)腹鰭和尾鰭特征區(qū)分性別。顯微鏡下解剖，分別采集腦、肝臟、性腺、脾臟、腸、胃、眼、心臟、鰓和肌肉組織，隨機(jī)將3尾魚的同一組織混合為一個(gè)樣品，共4個(gè)平行樣。

受精卵和子代仔魚的樣品采集如下:試驗(yàn)前一晚清空魚缸底部所有魚卵，次日8:00采集親本魚新鮮產(chǎn)出的受精卵，并轉(zhuǎn)移至新魚缸內(nèi)待孵化。采集魚卵樣品時(shí)，每20粒混合為一個(gè)樣品，共4個(gè)平行樣；魚卵從第9天開始，陸續(xù)孵化出仔魚。采集孵化后仔魚樣品時(shí)，每4尾混合為一個(gè)樣品，共設(shè)4個(gè)平行樣。所有樣品采集后，立即置于液氮中速凍后于超低溫冰箱 (－80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 水體暴露 取孵化后20 d(20 dph)的海水青鳉健康仔魚336尾，進(jìn)行EE2急性暴露試驗(yàn)。試驗(yàn)分為3組:健康對(duì)照組、溶劑DMSO對(duì)照組(VDMSO∶Vseawater＝1∶20 000) 和 EE2暴露組 (5、50、500 ng/L)。健康組16尾，溶劑對(duì)照組和EE2暴露的3個(gè)濃度組分別隨機(jī)分配80尾。每24 h更換全部的染毒液，整個(gè)暴露試驗(yàn)過(guò)程中不飼喂仔魚，分別于染毒后0、6、12、24、48、96 h時(shí)間點(diǎn)采樣。

1.2.3 RNA提取和基因克隆 利用TRIzol(Invitrogen)提取胚胎和仔魚的總RNA。提取過(guò)程中，為去除基因組 DNA的污染，使用 RNase－free DNase I(Promega)消化處理樣品RNA。使用Nanodrop 2000(Thermo)測(cè)定總RNA的濃度，RNA質(zhì)量通過(guò)15 g/L的瓊脂糖凝膠鑒定。取用DNase I消化處理后的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用作PCR模板。根據(jù)日本青鳉及其他硬骨魚雌激素受體基因的已知cDNA序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，首先擴(kuò)增海水青鳉雌激素受體基因的ORF序列，然后再根據(jù)已獲得的特異性序列，設(shè)計(jì)引物 (表1)，進(jìn)行RACE PCR擴(kuò)增，以獲得相應(yīng)的全長(zhǎng)cDNA序列，具體試驗(yàn)方法參見文獻(xiàn) [33]。

表1 本試驗(yàn)中用于基因克隆的引物Tab.1 Primers used in the gene cloning in the experiment

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用BLASTn進(jìn)行序列相似性分析，使用CLUSTAL W進(jìn)行序列比對(duì)分析。采用鄰位相接法 (Neighbor－Joining，NJ)以及MEGA 4.0軟件對(duì)不同物種的雌激素受體蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中以人Homo sapiens ERα、ERβ序列為外群，空位信息視為堿基缺失，自展檢驗(yàn)(bootstrap analysis)設(shè)為1000次。通過(guò)在線網(wǎng)站(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I－TASSER/)預(yù)測(cè)OM－ERα蛋白保守的DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域的3D結(jié)構(gòu)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取1 μg消化處理后的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于定量PCR檢測(cè)，SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法參照文獻(xiàn) [34]，所檢測(cè)的各目的基因的特異性引物序列分別為:OMERα (F:CGACGAGTCCTCTGGTGTTC， R:CTGTAAACGGGCGTGGAA)、 OM－ERβ1(F:GCCACGACTTCACCAGCATACC，R:CAGAACAAAGAGGCACTTAGCGAC)、 OM－ERβ2(F:CCCAAAGTCCACAACATCAATCC，R:CGTAATCGTGACACACAGGCACAGAA)、vtg1(F:AAGGCTGACCGTATCCTCCTGACTA，R: GATTTTTGGATTCCCTCTGGCACTT)、 RPL7(F:CTGAGGATTGCTGAGCCTTACAT，R:CTCAACACAGATGATGCCGTATT)。

反應(yīng)程序?yàn)?①50℃下2 min:激活UNG酶，消除體系配制過(guò)程中產(chǎn)生的非特異PCR產(chǎn)物的污染；②95℃下10 min:預(yù)變性，同時(shí)激活聚合酶、滅活UNG酶；③95℃下變性15 s，60℃下退火并延伸1 min，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；在60℃下再延伸并采集熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)反應(yīng)體系直接進(jìn)行溶解曲線分析試驗(yàn)，分析PCR產(chǎn)物特異性。反應(yīng)條件為:95℃下變性15 s，從60℃到95℃線性梯度升高溫度，全過(guò)程采集熒光信號(hào)，分析信號(hào)峰值，以確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。核糖體蛋白7基因 (RPL7)在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量較一致，且內(nèi)分泌干擾物暴露下表達(dá)量較穩(wěn)定[35]，故本研究中選取RPL7作為內(nèi)參基因。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，選擇模板cDNA的最佳稀釋倍數(shù)以及目的基因的特異性引物，按上述反應(yīng)體系進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增反應(yīng)并建立熔解曲線。以RPL7基因?yàn)閮?nèi)參，使用7500 system SDS 1.3.1.21軟件分析q－PCR反應(yīng)的熒光信號(hào)值，通過(guò)2－ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。使用Origin 8.5軟件繪制各基因表達(dá)水平的柱狀圖。使用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析 (Oneway ANOVA)，用Tukey法分析組間差異，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 海水青鳉雌激素受體亞型基因的克隆及序列分析

圖1 海水青鳉雌激素受體基因的cDNA序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.1 cDNA sequences and deduced amino acid sequences in estrogen receptor genes in marine medaka Oryzias melastigma

本研究中，克隆得到海水青鳉3個(gè)雌激素受體亞型基因 (OM－ERα/β1/β2)。 從圖 1可見:OM－ERα基因 (GenBank登錄號(hào):JF972761)的cDNA序列為2762 bp，包含一段82 bp的5′非編碼區(qū)，最長(zhǎng)開放閱讀框 (ORF)序列為1857 bp(含終止密碼子TAA)，共編碼618個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)蛋白分子量約為67 000；3′非編碼區(qū)為823 bp，包含多腺苷酸終止信號(hào)序列 (AATTAAA)，位于poly(A)上游2701～2707 bp的位置。OM－ERβ1基因(GenBank登錄號(hào):JF972762)的cDNA序列為2835 bp，最長(zhǎng)ORF序列1689 bp(含終止密碼子TAG)，共編碼562個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)蛋白分子量約為62 000；5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)分別為183 bp和963 bp，加尾信號(hào) (AATAA)位于poly(A)上游2725～2730 bp的位置。OM－ERβ2基因(GenBank登錄號(hào):JF972763)的cDNA序列為2471 bp，最長(zhǎng)ORF序列為1896 bp(含終止密碼子TGA)，共編碼631個(gè)氨基酸，5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)分別為101 bp和474 bp。

2.2 海水青鳉雌激素受體的結(jié)構(gòu)域分析

與其他核受體家族基因編碼的蛋白類似，OMERα/β1/β2編碼的蛋白均具有核受體超家族的6個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別劃分為A/B結(jié)構(gòu)域 (轉(zhuǎn)錄激活區(qū))、C結(jié)構(gòu)域 (DNA結(jié)合域，DBD)、D結(jié)構(gòu)域(鉸鏈區(qū))、E結(jié)構(gòu)域 (配體結(jié)合域，LBD)和F區(qū)。海水青鳉雌激素受體3個(gè)亞型基因開放閱讀框和各個(gè)結(jié)構(gòu)域的相似度見表2。氨基酸序列的多重比對(duì)分析 (圖2)表明，在6個(gè)結(jié)構(gòu)域中，DBD結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上最保守，LBD結(jié)構(gòu)域次之，D區(qū)(鉸鏈區(qū))和A/B區(qū) (轉(zhuǎn)錄激活區(qū))保守性較低。

2.3 海水青鳉雌激素受體系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)所獲得的海水青鳉雌激素受體的氨基酸序列，利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖3)，從魚類到哺乳動(dòng)物基本符合物種進(jìn)化規(guī)律。進(jìn)化樹顯示，OM－ERα與所有物種的ERα亞型聚為一支，所有的ERβ1和ERβ2聚在同一大支上，且大部分ERβ1聚為一分支，大部分ERβ2聚為一分支。

2.4 OM－ERα單體DBD和LBD結(jié)合域的3D模型建立

作為核受體家族的成員，雌激素受體蛋白的DNA結(jié)合域 (DBD)和配體結(jié)合域 (LBD)是兩個(gè)較為保守的區(qū)域，其中DBD最為保守。通過(guò)在線網(wǎng)站 (http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I－TASSER/) 構(gòu)建OM－ERα單體的DBD和LBD的3D模型，DBD含有兩個(gè)α－螺旋結(jié)構(gòu)，LBD含有5個(gè)α－螺旋結(jié)構(gòu) (圖4)。

表2 海水青鳉3個(gè)雌激素受體氨基酸相似度比較Tab.2 Amino acid identities among three estrogen receptors in marine medaka Oryzias melastigma %

2.5 OM－ERα/β1/β2基因在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)特性

從圖5可見:OM－ERα在海水青鳉胚胎第4天(4 dpf)，直到孵化后不同時(shí)間點(diǎn) (1～30 dph)其表達(dá)量整體上無(wú)明顯變化規(guī)律；OM－ERβ1在4 dpf胚胎表達(dá)量最低，隨后表達(dá)量逐漸升高，且在孵化的當(dāng)天 (1 dph)表達(dá)量出現(xiàn)一個(gè)峰值，其后緩慢下降，并在30 dph時(shí)表達(dá)量又上升；OM－ERβ2的表達(dá)量從4 dpf到16 dph持續(xù)升高，并在16 dph和30 dph時(shí)階段表達(dá)量為最高。

OM－ERα在海水青鳉雄性和雌性的性腺和脾臟中表達(dá)量最高，其次在雌性肝臟中表達(dá)量也較高，但在雄性肝臟中表達(dá)量較低，雌、雄肝臟間有顯著性差異 (P＜0.05)；在腦、腸、胃、眼、鰓、心臟、肌肉等其他組織中也檢測(cè)到OM－ERα mRNA的轉(zhuǎn)錄，但表達(dá)量相對(duì)較低，且各組織間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)。OM－ERβ1在雌雄青鳉的肝臟、性腺 (精巢和卵巢)、腸和胃中表達(dá)量相對(duì)較高，且在雄性性腺和胃中的表達(dá)量顯著高于雌性 (P＜0.05)。OM－ERβ2在雌雄青鳉的肝臟和性腺 (精巢和卵巢)中高表達(dá)，且精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢 (P＜0.05)；其次在胃和腸中的表達(dá)量相對(duì)較高；其他組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，且各組織間無(wú)顯著性差異 (P＞0.05)。

圖2 海水青鳉3個(gè)雌激素受體基因推導(dǎo)的氨基酸序列與人類ERα氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Comparison of amino acid sequence alignment of three estrogen receptor genes in marine medaka Oryzias melastigma with human ERα(P03372)

2.6 EE2急性暴露下海水青鳉仔魚OM－ERα/β1/β2基因的表達(dá)特性

對(duì)孵化后20 d(20 dph)的海水青鳉仔魚進(jìn)行EE2急性染毒試驗(yàn) (96 h)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可見:與溶劑對(duì)照組相比，OM－ERα僅在50 ng/L EE2中暴露6 h時(shí)顯著上調(diào)達(dá)2.1倍 (P＜0.05)(圖6－A)； EE2暴露后 6～96 h， 50 ng/L EE2顯著誘導(dǎo)OM－ERβ1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá) (P＜0.05) (圖6－B)，但5 ng/L與500 ng/L EE2均未影響 OMERβ1的表達(dá) (P＜0.05)； OM－ERβ2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)呈現(xiàn)EE2低濃度誘導(dǎo)、高濃度抑制的趨勢(shì)，尤其是在低濃度 (5 ng/L)EE2中暴露6 h后，OM－ERβ2表達(dá)較溶劑對(duì)照組上調(diào)5.9倍；在中濃度 (50 ng/L)中暴露6 h后，也可誘導(dǎo)OM－ERβ2的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)量較溶劑對(duì)照組上調(diào)2.5倍 (圖6－C)；分子標(biāo)志物vtg1也被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)答模式呈濃度依賴和時(shí)間依賴關(guān)系 (圖6－D)。

圖3 基于雌激素受體氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Neighbor－Joining(NJ)tree constructed based on the amino acid sequences of estrogen receptors from vertebrates

圖4 OM－ERα單體DNA結(jié)合域 (DBD)和配體結(jié)合域 (LBD)的3D模型Fig.4 Tridimensional models of the nonamer DNA and ligand binding domain of OM－ERα

3 討論

3.1 海水青鳉雌激素受體基因OM－ERα/β1/β2序列分析

本研究中克隆獲得了海水青鳉3個(gè)雌激素受體亞型基因 (OM－ERα/β1/β2)，進(jìn)化樹分析表明，其分別屬于各自的雌激素受體亞型聚類，ERα和ERβ分屬兩大類群，說(shuō)明異型ER的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而ERβ亞型又分為β1和β2兩支，說(shuō)明他們的親緣關(guān)系較近。

序列分析顯示，海水青鳉雌激素受體屬于典型的核受體家族成員，這與已報(bào)道的人類、老鼠及其他魚類的結(jié)果相似，結(jié)構(gòu)上分為6個(gè)功能域[11]。DBD結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上高度保守，參與DNA的結(jié)合，此區(qū)域含有8個(gè)保守的半胱氨酸，參與鋅指結(jié)構(gòu)的形成，這兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)受體與特定DNA序列的結(jié)合，從而進(jìn)一步調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)；保守的 P－box(CEGCKA)和 D－box(PATNQ)存在于C結(jié)構(gòu)域，P－box參與DNA識(shí)別，D－box參與DNA依賴性二聚化[11]。LBD結(jié)構(gòu)域氨基酸數(shù)量最多，發(fā)揮的作用最大，5個(gè)保守的螺旋結(jié)構(gòu)即位于此區(qū)域，他們參與配體的結(jié)合。此外，依賴配體的轉(zhuǎn)錄激活區(qū) (AF－2，序列為YDLLLEML)也位于此區(qū)域，當(dāng)AF－2與不同的雌激素接觸時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出不同的構(gòu)象變化，以此來(lái)決定結(jié)合特異性的輔助因子以調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[11，36]。此外，一個(gè)潛在的AP－1結(jié)合位點(diǎn)[CGACTAC替代為TGA(GC)T(C/A)A]位于DBD結(jié)構(gòu)域，其可能參與通過(guò)蛋白/蛋白互作的方式激活ER，從而介導(dǎo)AP－1蛋白的合成[11，36]。海水青鳉雌激素受體基因OM－ERα/β1/β2編碼蛋白的保守氨基酸殘基和重要功能結(jié)構(gòu)域的存在，暗示他們具有相似的生理功能。OM－ERα/β1/β2編碼蛋白的A/B結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度差異很大，這暗示其在非配體依賴性的轉(zhuǎn)錄激活功能上存在差異[37]。與人類 ERα相似，海水青鳉 OMERα/β1/β2編碼蛋白的A/B結(jié)構(gòu)域富含S和P氨基酸殘基，同時(shí)含有潛在MAPK激酶 (mitogen－activated protein kinase， MAPK) 作用位點(diǎn)[P－X(1，2)－S－P)]，MAPK可以通過(guò)作用于保守的絲氨酸殘基 (對(duì)應(yīng)hERα第118號(hào)絲氨酸殘基)磷酸化該位點(diǎn)[38－39]。

3.2 海水青鳉雌激素受體基因OM－ERα/β1/β2的組織表達(dá)特征

OM－ERα/β1/β2 在所檢測(cè)的海水青鳉肝臟、 性腺、腦等10種組織中均有表達(dá)。其中，OM－ERα在雌魚肝臟中表達(dá)量較高，但在雄魚肝臟中表達(dá)量較低，表明OM－ERα基因在海水青鳉肝臟內(nèi)的表達(dá)存在性別差異 (P＜0.05)。海水青鳉雄魚肝臟內(nèi)OM－ERα基因表達(dá)量低，這與已報(bào)道的其他魚類不同，如斑馬魚[17]、大嘴鱸[18]、虹鱒 (ERα1)[22]朝鮮鱊Acheilognathus yamatsutae[36]和稀有鮈鯽Gobiocypris rarus[4]。雌激素E2通過(guò)ERα促使卵黃蛋白前體vtg(卵黃蛋白原)在雌魚肝臟內(nèi)合成[22]，因?yàn)樾埕~體內(nèi)E2水平很低，肝臟內(nèi)ERα表達(dá)量通常比雌魚低很多[18，40]。這與本研究結(jié)果相同。

注:dpf表示受精后天數(shù)，dph表示孵化后天數(shù)；內(nèi)參基因?yàn)镽PL7；A、B、C圖中，標(biāo)有不同小寫字母表示組間有顯性差異 (P＜0.05)；D、E、F圖中，標(biāo)有不同小寫字母者表示雌魚各組織間有顯著性差異 (P＜0.05)，標(biāo)有不同大寫字母者表示雄魚各組織間有顯著性差異(P＜0.05)；標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異 (P＜0.05)；?表同一組織雌雄魚間有顯著性差異 (P＜0.05)Note:dpf＝ days post fertilization，dph ＝ days post hatching； RPL7 as reference gene；In the Figures A， B and C，the means with different letters are significant differences in various group；in Figures D， E dand F，the means with different letters are significant difference among all the tested tissues in female fish at the 0.05 probability level， the means with capital letters are significant differences in male， and the means with same letters are not significant differences； ?denotes significant difference in both male and female(P＜0.05)

海水青鳉雌激素受體基因同樣在性腺內(nèi)高表達(dá)，但OM－ERβ1/β2在性腺中的表達(dá)存在雌雄差異，雄性顯著高于雌性，這與對(duì)尼羅羅非魚的研究結(jié)果相似[19]。已有研究顯示，雌激素受體的組織特異性表達(dá)與功能密切相關(guān)。肝臟和性腺中的雌激素受體在與配體特異性結(jié)合后，分別調(diào)控與生殖相關(guān)基因的表達(dá)以及與卵黃蛋白原蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控性腺的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖周期的變化[18]。 OM－ERα/β1/β2在肝臟 (雄魚 OM－ERα 除外)和性腺中高表達(dá)，暗示他們與生殖活動(dòng)的調(diào)控關(guān)系密切。E2通常被認(rèn)為是雌性特異性激素，但這一傳統(tǒng)觀點(diǎn)近些年受到挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素、雌激素受體和芳香酶在雄性個(gè)體睪丸中均存在[41－42]。大黃魚3個(gè)雌激素受體基因 (LcERs)在肝臟和性腺中的表達(dá)具有性別特異性和發(fā)育階段特異性，并推測(cè)LcERα和LcERβ2與雌魚肝臟中E2的生理學(xué)作用有關(guān)，LcERβ2與雄魚肝臟中卵黃生成作用調(diào)控有關(guān)[20]。因此，雄魚精巢內(nèi)高表達(dá)的ER可能與ER介導(dǎo)的精巢功能和精子發(fā)生有關(guān)，而雌魚卵巢內(nèi)ER高表達(dá)與卵巢功能有關(guān)。本研究中，ER在卵巢中的表達(dá)水平不同，暗示不同亞型的ER以性別特異性的方式在繁殖中扮演不同的角色，但其各自的具體功能需要進(jìn)一步研究闡明。

圖6 EE2對(duì)海水青鳉仔魚雌激素受體基因轉(zhuǎn)錄的影響(DMSO＝0.005%，20 dph)Fig.6 Effects of EE2 on transcript abundance of ER mRNAs in marine medaka larvae(DMSO＝0.005%，20 dph)

3.3 環(huán)境雌激素EE2對(duì)海水青鳉仔魚OM－ERα/β1/β2基因表達(dá)的影響

關(guān)于環(huán)境雌激素對(duì)魚類的影響，近年來(lái)已有相關(guān)研究報(bào)道。而多數(shù)研究是利用成魚進(jìn)行染毒試驗(yàn)。本研究中將海水青鳉仔魚暴露于不同濃度的EE2水體中， 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其 OM－ERα/β1/β2基因及vtg1基因均可不同程度地響應(yīng)EE2刺激，但是響應(yīng)程度不同。結(jié)果顯示，仔魚中分子標(biāo)志物基因vtg1被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且其表達(dá)與EE2暴露濃度呈劑量依賴關(guān)系。值得注意的是，OM－ERβ1基因在50 ng/L EE2暴露下上調(diào)表達(dá)，低濃度 (5 ng/L)EE2誘導(dǎo)OM－ERβ2基因上調(diào)表達(dá)，而高濃度 (500 ng/L)的EE2則抑制其表達(dá)。這一結(jié)果與已有研究類似:在不同濃度 (0.01、0.10、1.00 nmol/L)的EE2中暴露3 d，顯著抑制了稀有鮈鯽仔魚ERβ1基因的表達(dá)，但是ERβ2的應(yīng)答模式呈現(xiàn)低劑量誘導(dǎo)、高劑量抑制的趨勢(shì)[4]。本研究中所使用的EE2濃度單為ng/L，換算后分別相當(dāng)于0.017、0.170、1.700 nmol/L，與上述研究中所使用的濃度 (0.01、0.10、1.00 nmol/L)范圍相當(dāng)。已有報(bào)道指出，內(nèi)分泌干擾物的作用效應(yīng)通常不是單一的劑量反應(yīng)關(guān)系，而是在劑量與響應(yīng)之間存在一種倒U型的關(guān)系[43]，本研究中OM－ERβ2的應(yīng)答模式即符合該模型。因此，可以認(rèn)為，不同魚類對(duì)同一種內(nèi)分泌干擾物的敏感度不同，而水體暴露的濃度、暴露方式和暴露時(shí)間等都是評(píng)價(jià)這一問(wèn)題的重要因子[5－6]。

綜上，海水青鳉20日齡仔魚可以作為生物模型使用。

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