響應面優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取紫米原花青素工藝

程海濤,申獻雙

(1.衡水學院化工學院,河北衡水 053000;2.衡水學院美術(shù)學院,河北衡水 053000)

原花青素主要是多酚類物質(zhì),是由黃烷-3-醇和黃烷-3,4-二酚的配位縮合或聚合而成的低聚或多聚物,可以有效清除人體內(nèi)產(chǎn)生的活潑自由基[1-4]。原花青素在植物體的組織內(nèi)廣泛存在,從化學組成分析,它是一種聚合體,聚合單體是兒茶素或表兒茶素,聚合單體數(shù)目不等[5-7]。聚合后聚合體官能團差別較大,進而引起其活性的差異,其中抗氧化性與聚合度成反比[8]。原花青素在化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應用,可強化動脈、靜脈和毛細血管,有效清淤化腫[9-13],加快毛細血管血液流動速度,減少毛細血管阻力,改善血管滲透性,從而提高組織細胞新陳代謝過程,使組織器官吸收養(yǎng)分和排除廢棄物更加自由[14-17]。

超聲波是頻率高于20 kHz不引起聽覺的彈性波。超聲波產(chǎn)生的熱效應、機械作用、空化效應可以縮短反應時間,提高反應產(chǎn)率,降低反應條件。微波是頻率介于300 MHz～300 GHz之間的電磁波,具有穿透力強、選擇性好、加熱效率高等特點[18]。原花青素提取方法有溶劑法、超聲提取法、超臨界提取法、酶提取法。單純利用超聲波或者微波提取原青花素已經(jīng)有相關(guān)研究但是得率不是太高[19-21]。超聲-微波協(xié)同作用對于化學反應、物質(zhì)提取具有很強的強化作用,優(yōu)點是提取時間短、溫度一般較低、收率高,但是目前對超聲-微波協(xié)同提取紫米中原花青素的工藝的研究尚未見報道。

本研究以云南墨江紫米為研究對象,利用超聲波-微波協(xié)同作用強化紫米中原花青素提取工藝,以單因素實驗為基礎(chǔ),研究了超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間、液料比等影響因素對紫米中原花青素得率的影響,采用響應面法優(yōu)化了超聲波-微波協(xié)同作用強化紫米中原花青素提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫米 云南墨江;無水乙醇 分析純,天津市大茂化學試劑廠;甲醇 分析純,天津市大茂化學試劑廠;硫酸 分析純,天津市大茂化學試劑廠;香草醛 分析純,天津市大茂化學試劑廠;原花青素標準品 純度99.9%,天津市大茂化學試劑廠。

JYD-650型超聲波發(fā)生器 上海之信儀器有限公司;WD900G型格蘭仕家用微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司;T6新型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-S4型恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司;FW80型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;TP-A100型電子天平 金壇市國旺實驗儀器廠;AR1140型離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原花青素標準曲線的繪制 準確稱取一定質(zhì)量的原花青素標準品,用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,依次配制濃度分別為1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mg/mL的原花青素做標準溶液。利用香草醛-鹽酸法[22]測定其吸光度,繪制標準曲線,標準曲線方程:y=0.4514x-0.0356,R2=0.9996。

1.2.2 紫米中原花青素提取工藝 紫米用粉碎機粉碎后過60目篩,在40 ℃環(huán)境下干燥使其水分含量低于10%,并儲存于-20 ℃環(huán)境下備用。稱取一定質(zhì)量紫米粉,按一定液料比(即乙醇溶液與紫米粉體積質(zhì)量比)加入乙醇水溶液,在設定的乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間下恒溫攪拌浸提,首先經(jīng)過超聲波處理,再進行微波處理,抽濾,保存濾液。

1.2.3 紫米中原花青素得率的測定

1.2.3.1 紫米樣品中原花青素濃度的測定 首先,利用香草醛—鹽酸法[19]測定其吸光度,具體如下:精確量取0.5 mL試樣液緩慢放入10 mL的試管中,然后加入2.5 mL的 1%香草醛-甲醇的溶液和2.5 mL的30%濃鹽酸-甲醇的溶液,并在30 ℃水浴避光環(huán)境中反應20 min,以0.5 mL的甲醇代替樣液做為空白對照實驗,在500 nm波長處測定其吸光度,記錄實驗測量的吸光度。再根據(jù)測得的原花青素標準曲線方程,確定紫米樣品中原花青素濃度。

1.2.3.2 紫米中原花青素得率計算 精密吸取紫米中原花青素提取溶液 1.0 mL,按 1.2.3.1 方法進行操作并測定吸光度[14],每個實驗重復三次。按以下公式計算得率:

紫米中原花青素得率Y(%)=[VCn/(1000×W)]×100

式中,V:提取液體積(mL);C:提取液中紫米原花青素濃度(mg/mL);n:提取液稀釋倍數(shù);W:紫米粉質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實驗設計 以乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間為影響因素,考察其對紫米原花青素得率的影響。乙醇體積分數(shù)變化范圍30%、40%、50%、60%、70%,液料比變化范圍10、15、20、25、30 mL/g,超聲波功率變化范圍300、350、400、450、500 W,超聲時間變化范圍20、30、35、40、45 min,微波功率變化范圍250、300、350、400、450 W,微波時間變化范圍1、2、3、4、5 min。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取得率為響應值Y,液料比(X1),超聲時間(X2),微波功率(X3),微波時間(X4)的變化因素,根據(jù) Box-Benhnken 的實驗設計原理,通過SAS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,確定最佳工藝。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,設計4因素3水平的響應面優(yōu)化實驗如下表1所示。

表1 響應面因素和水平Table 1 The factor and level of the response surface

1.3 對照實驗

超聲提取:乙醇體積分數(shù)50%,液料比22 mL/g,超聲功率400 W,超聲時間33 min工藝條件下做三次平行實驗。

微波提取:在乙醇體積分數(shù)50%,液料比22 mL/g,微波功率350 W,微波時間3.3 min工藝條件下做三次平行實驗。

超聲-微波協(xié)同提取:在超聲-微波協(xié)同最優(yōu)工藝條件下做三次平行實驗。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

響應面實驗設計與數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.2軟件處理數(shù)據(jù);單因素實驗數(shù)據(jù)圖表處理采用EXCEL 2003軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波-微波協(xié)同提取紫米原花青素工藝單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對得率的影響 由圖1可以看出,得率隨乙醇體積分數(shù)增加逐步增大,體積分數(shù)為50%時得率達到6.94%,超過50%后得率開始降低,降低趨勢平緩。原因可能是原花青素為極性化合物,易溶于極性溶劑,乙醇的加入提高了溶液的極性,有利于原花青素的提取,但是有機溶劑滲透性差,需要水作為傳質(zhì)劑,因此乙醇溶度不宜過高,太高會導致傳質(zhì)性降低,不利于原花青素的提取。因此,選擇適宜乙醇體積分數(shù)為50%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對得率的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction on the extraction

2.1.2 液料比對得率的影響 由圖2可以看出得率隨液料比的增大,呈現(xiàn)上升趨勢,液料比為20時得率為6.96%,液料比繼續(xù)增大,得率不再增加反而開始降低,降低趨勢較大。液料比越大,紫米中原花青素與乙醇溶液的濃度差越大,越容易析出,但是液料比太大,單位體積提取液受到的超聲波的熱效應、機械作用、空化效應與微波的穿透力、選擇性、加熱效率都會降低,不利于原花青素的提取。因此,在響應面優(yōu)化實驗過程中對液料比進行進一步優(yōu)化,優(yōu)化范圍為10～30 (mL/g)。

圖2 液料比對得率的影響Fig.2 Effects of liquid-solid on the yield

2.1.3 超聲功率對得率的影響 由圖3可知,在超聲波功率逐步增大趨勢下,得率呈上升趨勢,超聲功率400 W時得率為6.95%,超聲功率繼續(xù)增大,得率不再有明顯上升趨勢,趨于平緩,超聲波與介質(zhì)相互作用時,超聲波功率起決定性作用。一般情況下隨超聲波功率增加,空化作用變得強烈,得率增加,但是功率太大會造成原花青素的降解,從而得率降低?？紤]實驗條件等綜合因素,超聲波-微波協(xié)同提取紫米原花青素最佳工藝中超聲功率400 W為最佳工藝條件。

圖3 超聲功率對得率的影響Fig.3 Effects of ultrasound power on the yield

2.1.4 超聲時間對得率的影響 由圖4可以看出，隨超聲時間的增加,得率逐步增大,時間達到30 min得率最大為6.95%,時間再增加，得率開始緩慢下降,降低趨勢較大。因為超聲時間太長,有效成分降解或被超聲波破壞,同時雜質(zhì)可隨有效成分一起被提取出來,而且超聲時間越長,雜質(zhì)含量越高,得率降低越快。因此,在響應面優(yōu)化實驗過程中對超聲時間進行進一步優(yōu)化,優(yōu)化范圍為20～40 min。

圖4 超聲時間對得率的影響Fig.4 Effects of ultrasound time on the yield

2.1.5 微波功率對得率的影響 由圖5可知,微波功率增大的情況下得率逐步增大,微波功率為350 W時得率為6.93%,微波功率繼續(xù)增大,得率開始緩慢下降，且降低趨勢較大。因為微波功率越大產(chǎn)生的熱效應越高,提高原花青素分子動能,得率會增大,但是微波功率過大產(chǎn)生過多熱效應將使原花青素降解加速,因此得率降低。在響應面優(yōu)化實驗過程中對微波功率進行進一步優(yōu)化,優(yōu)化范圍為300～400 W。

圖5 微波功率對得率的影響Fig.5 Effects of microwave power on the yield

2.1.6 微波時間對得率的影響 由圖6可以看出,得率隨微波時間的增加而增大,微波時間為3 min時得率為6.96%,時間再增加得率變小,降低趨勢較大。因為微波時間的增加造成熱量的積累,開始有利于原花青素分子的析出,但是溫度過高,造成分子結(jié)構(gòu)的破壞,造成得率下降。因此,在響應面優(yōu)化實驗過程中對微波時間進行進一步優(yōu)化,優(yōu)化范圍為1～5 min。

圖6 微波時間對得率的影響Fig.6 Effects of microwave time on the yield

2.2 響應面優(yōu)化超聲波-微波協(xié)同提取紫米原花青素工藝

2.2.1 響應面實驗

2.2.2 響應面優(yōu)化工藝回歸方程建立 通過單因素實驗結(jié)果可以看出影響因素中乙醇體積分數(shù)、超聲功率為50%、400 W時得率最大,再增加得率變化不再明顯,同時考慮實際實驗條件,確定最優(yōu)條件下乙醇體積分數(shù)、超聲功率為50%、400 W。

選取得率為響應值Y,液料比(X1),超聲時間(X2),微波功率(X3),微波時間(X4)為自變因素,根據(jù)Box-Benhnken 的實驗設計原理,設計四因素三水平的響應面實驗(見表2),實驗結(jié)果見表3。通過擬合回歸處理數(shù)據(jù)得到擬合函數(shù)模型:

表2 響應面實驗方案及實驗結(jié)果Table 2 The response surface experiment scheme and experimental results

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 The regression analysis results

Y=7.063333+0.108333X1+0.119167X2+0.061667X3+0.0775X4-0.38625X12-0.1075X1X2-0.01X1X3-0.0825X1X4-0.4125X22-0.1625X2X3-0.0675X2X4-0.42375X32+0.0375X3X4-0.26X42

由回歸結(jié)果看出，函數(shù)模型R2=99.73%,說明模型計算值和實驗值擬合度高,模型確定的方程預測超聲波-微波協(xié)同提取紫米原花青素得率最大值是可信的。由回歸方程的方差分析結(jié)果可以看出液料比(X1),超聲時間(X2),微波功率(X3),微波時間(X4)四個影響因素影響程度X2>X1>X4>X3,影響因素之間的交互影響 X1X3不顯著,其余項影響極顯著。

2.2.3 各因素交互作用分析 由圖7可知,響應面坡度比較陡峭,說明X1液料比和X2超聲時間對紫米中原花青素的得率的影響較大。在X1液料比9～27 mL/g、X2超聲時間18～36 min的范圍內(nèi)存在極值,兩因素對得率的交互作用顯著。

圖7 X1和X2交互作用影響得率的響應面圖Fig.7 Response surface graphs showing the interactive effects of X1 and X2 on the extraction

原因在于液料比越大得率越高,而在一定液料比下超聲時間越長,得率會降低,因此X1液料比和X2超聲時間對紫米中原花青素的得率交互影響作用顯著。

由圖8可知,X1液料比和X4微波時間對紫米中原花青素的得率的影響較大。在X1液料比9～27 mL/g、X4微波時間0.9～4.5 min的范圍內(nèi)存在極值,兩因素對得率的交互作用顯著。原因在于液料比越大微波時間越長,得率越高,一定液料比下微波時間越長得率會下降,因此X1液料比和X4微波時間對紫米中原花青素的得率交互影響作用顯著。

圖8 X1和X4交互作用影響得率的響應面圖Fig.8 Response surface graphs showing the interactive effects of X1 and X4 on the extraction

由圖9可知,X2超聲時間和X3微波功率對紫米中原花青素的得率的影響較大。在X2超聲時間18～36 min、X3微波功率270～360W的范圍內(nèi)存在極值,兩因素對得率的交互作用顯著。原因在于微波功率越大得率越高,一定微波功率下超聲時間越長得率會降低。

圖9 X2和X3交互作用影響得率的響應面圖Fig.9 Response surface graphs showing the interactive effects of X2 and X3 on the extraction

由圖10可知,X2超聲時間和X4微波時間對紫米中原花青素的得率的影響較大。在X2超聲時間18～36 min、X4微波時間0.9～4.5 min的范圍內(nèi)存在極值,兩因素對得率的交互作用顯著。原因在于微波時間、超聲時間越長越有利于原花青素提取,但是過長微波時間、超聲時間造成原花青素的結(jié)構(gòu)變化,會導致得率降低。

圖10 X2和X4交互作用影響得率的響應面圖Fig.10 Response surface graphs showing the interactive effects of X2 and X4 on the extraction

2.2.4 響應面優(yōu)化工藝實際驗證實驗 對經(jīng)過響應面優(yōu)化得到的數(shù)學回歸方程進行求極大值,得到X1為22 mL/g,X2為33 min,X3為350 W,X4為3.3 min,得率預測最大值為7.09%。根據(jù)響應面優(yōu)化結(jié)果和綜合因素影響得到超聲波-微波協(xié)同提取紫米原花青素最佳工藝是:乙醇體積分數(shù)50%,液料比22 mL/g,超聲功率400 W,超聲時間33 min,微波功率350 W,微波時間3.3 min。在最優(yōu)條件下進行3次實驗,實驗結(jié)果表明得率為7.09%±0.01%，與數(shù)學模型求極值得到數(shù)值相差很小,同時證明得到的數(shù)學回歸擬合模型可信度很高。

圖11 X3和X4交互作用影響得率的響應面圖Fig.11 Response surface graphs showing the interactive effects of X3 and X4on the extraction

2.2.5 對照實驗結(jié)果 采用超聲波與微波單獨提取紫米中的原花青素,得率遠低于超聲波-微波協(xié)同提取的得率,如圖12所示。

圖12 微波、超聲波、超聲波微波協(xié)同處理得率Fig.12 The yield of ultrasonic wave、microwave and ultrasonic microwave processing together

3 結(jié)論

本實驗利用超聲波-微波協(xié)同提取了紫米中原花青素,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過響應面Box-Benhnken實驗設計與響應面分析對超聲波-微波提取紫米中原花青素工藝進行優(yōu)化,得到了最佳工藝:乙醇體積分數(shù)50%,液料比22 mL/g,超聲功率400W,超聲時間33 min,微波功率350W,微波時間3.3 min,得率7.09%。實驗證明超聲波-微波協(xié)同提取紫米中原花青素的工藝是可行的。對比實驗證明,超聲波-微波協(xié)同提取紫米中原花青素與單純利用超聲波與微波提取紫米中原花青素相比,得率分別提高2.72%、4.72%。

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