黃秋葵超微粉多糖提取工藝的 優(yōu)化及其抗氧化活性測定

于 梅,單凌越,井瑞潔,張 鯤,張雅群,岳鳳麗,*

(1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東濟(jì)南 250100;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

黃秋葵又名洋辣椒,隸屬錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(Abelmoschusmanihot(L.)Medic)[1],在我國廣泛種植,產(chǎn)量豐富,味道鮮美且營養(yǎng)豐富,含有蛋白質(zhì)、膳食纖維、游離氨基酸、多種維生素和礦物質(zhì)。研究顯示,黃秋葵具有保健功效,可以降血脂、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化等[2-4]。

但目前對黃秋葵的開發(fā)利用僅停留在初加工水平,產(chǎn)品形式有鮮品、干制品、膨化品、罐頭制品等且技術(shù)含量不高[5],為提高黃秋葵的附加值,開發(fā)精深加工產(chǎn)品,對黃秋葵進(jìn)行多糖物質(zhì)的提取及抗氧化活性研究意義重大。超微粉碎是一項現(xiàn)代高新技術(shù),可將3 mm以上的物料顆粒瞬間粉碎至10～25 μm,在粉碎過程中不會產(chǎn)生局部過熱現(xiàn)象,粉碎速度快,最大限度地保留粉體的生物活性成分,有助于提高活性成分的利用率,可充分實現(xiàn)黃秋葵資源的高效利用[5-7]。在多糖提取的研究中,大多原料是通過粉碎處理,過40～80目篩[8]。而本文將黃秋葵原料,經(jīng)超微粉碎過300目篩。目前,這種以黃秋葵超微粉進(jìn)行多糖的提取及抗氧化活性測定的研究未見報道。

本文為提高黃秋葵中多糖的得率及抗氧化活性,采用超聲波-微波協(xié)同提取黃秋葵超微粉中的多糖,通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件,并測定其抗氧化活性,為黃秋葵的進(jìn)一步開發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃秋葵果實 江西萍鄉(xiāng)產(chǎn)棱角種,青島城陽區(qū)大潤發(fā)超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) Sigma公司;二硫蘇糖醇(DTT) Solarbio公司;鄰二氮菲、三氯乙酸(TCA)、葡萄糖、焦性沒食子酸、濃硫酸、苯酚、鐵氰化鉀、三氯化鐵等試劑 國產(chǎn)分析純。

DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;DU-800型紫外可見分光光度計 美國貝克曼公司;WF-20型萬能粉碎機(jī) 江陰耐馳機(jī)械科技有限公司;XO-SM200超聲波-微波組合系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司;WZJ-6J型振動式超細(xì)粉碎機(jī) 濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司;RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;FD-1D-80冷凍干燥機(jī) 美國西蒙公司;電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃秋葵超微粉的制備 新鮮的黃秋葵果實洗凈切塊,50 ℃下烘干72 h,用萬能粉碎機(jī)粉碎過80目篩,得黃秋葵粗粉,然后用振動式超細(xì)粉碎機(jī)處理粗粉,得300目黃秋葵超微粉,置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 黃秋葵超微粉多糖的提取 準(zhǔn)確稱取黃秋葵超微粉1.00 g,按設(shè)定好的料液比放入盛有蒸餾水的三角瓶中,置于磁力攪拌器上攪拌均勻,放入超聲波-微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行處理。處理完的黃秋葵溶液于5000 r/min、4 ℃下離心15 min,取上清液,加水定容至50 mL備用。采用苯酚-硫酸法測定黃秋葵超微粉中多糖的含量[9]。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0098x+0.0095,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996計算多糖得率。

多糖得率(%)=提取的多糖質(zhì)量/黃秋葵超微粉質(zhì)量×100

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 料液比對多糖得率的影響 選取微波時間2 min,微波功率800 W,超聲波時間15 min,超聲波功率700 W的條件,考察不同料液比1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120 (g∶mL)對多糖得率的影響。

1.2.3.2 微波時間對多糖得率的影響 選取超聲波時間15 min,微波功率800 W,超聲波功率為700 W,料液比1∶100 (g∶mL)的條件,考察不同微波時間0.5、1、2、3、4 min對多糖得率的影響。

1.2.3.3 超聲波時間對多糖得率的影響 選取微波時間2 min,微波功率800 W,超聲波功率為700 W,料液比1∶100 (g∶mL)的條件,考察不同超聲波時間5、10、15、20、25 min對多糖得率的影響。

1.2.3.4 超聲波功率對多糖得率的影響 選取微波時間2 min,微波功率800 W,超聲波時間為15 min,料液比1∶100 (g∶mL)的條件,考察不同超聲波功率100、300、500、700、900 W對多糖得率的影響。

1.2.4 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選擇3個對多糖得率影響較大的因素,每個因素選取三個水平,以多糖得率為響應(yīng)值,建立三因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗,如表1。

表1 響應(yīng)曲面設(shè)計實驗因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.5 體外抗氧化活性實驗 在最佳工藝條件下提取的黃秋葵超微粉多糖溶液用四倍體積乙醇醇沉得多糖沉淀,將其在-80 ℃下冷凍干燥得到多糖粉,配制一定濃度的多糖溶液,測定所得多糖的體外抗氧化活性。

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測定 取4支試管分別編號,0號試管只加入浸提試劑,1號試管加入浸提試劑和2.4 mL 0.1 mmoL/L DPPH自由基乙醇溶液,2號試管分別加入2.4 mL 0.1 mmoL/L DPPH自由基乙醇溶液、浸提試劑以及多糖溶液,3號試管加入無水乙醇、浸提試劑以及多糖溶液充分混勻,黑暗處靜置30 min,測517 nm處的吸光值[10]。分別記為An(n取0～3)。清除率計算公式:

清除率(%)=[1-(A2-A3)/A1]×100

1.2.5.2 超氧陰離子自由基清除率的測定 取4支試管分別加入5 mL Tris-HCl緩沖液,0、1號試管加入50 μL浸提試劑,2、3號試管加入50 μL待測的多糖溶液,25 ℃下靜置20 min,0、3號加入40 μL鹽酸,1、2號加 40 μL 25 mmoL/L鄰苯三酚,混勻計時,保證每個試管反應(yīng)3 min后加入50 μL DTT終止反應(yīng),316 nm處測定吸光值[11]。吸光值分別記為An(n取0～3)。清除率計算公式:

清除率(%)=[(A1-A2+A3)/A1]×100

1.2.5.3 羥自由基清除率的測定 取5支試管加入PBS(pH=7.4)緩沖溶液,0、1、3號試管加入蒸餾水,3、4號試管加入待測多糖溶液,0、1、2號試管加入浸提試劑,1、2、4號試管加入7.5 mmol/L的鄰二氮菲和硫酸亞鐵溶液,2、4號管加入1%雙氧水,37 ℃靜置90 min,536 nm處測定吸光值[12]。吸光值分別記為An(n取0～4)。清除率計算公式:

清除率(%)=[(A4-A3-A2)/A1-A2]×100

1.2.5.4 還原力測定 取0、1號試管,分別加入蒸餾水和待測的多糖溶液,再向0、1號加入PBS(pH=6.6)緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液,充分混勻后于50 ℃下放置20 min,快速冷卻后加入10% TCA,混勻,5000 r/min離心10 min,取上清液加1%三氯化鐵溶液和蒸餾水,混勻靜置5 min,在700 nm處測定吸光值[13]。其中,還原能力的大小與吸光值成正相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對多糖得率的影響 由圖1可知,多糖得率隨料液比的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,在料液比為1∶100 (g∶mL)時,多糖得率最大為27.20%。分析原因可能是溶劑體積的增加使得溶液中多糖濃度下降,使得多糖擴(kuò)散的壓力差增大,利于多糖擴(kuò)散,但是多糖的擴(kuò)散量是一定的,繼續(xù)加大溶劑比例,也不會促進(jìn)多糖擴(kuò)散[14]。因此選擇適宜料液比為1∶100 (g∶mL)左右。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ratios of material to water on the yield of polysaccharides

2.1.2 微波時間對多糖得率的影響 由圖2可知,黃秋葵中多糖的得率隨著微波時間的延長呈現(xiàn)先增大后趨勢變化不顯著,多糖得率在2 min處最高,達(dá)到24.96%。這是由于隨著處理時間的延長,微波處理會破壞細(xì)胞壁,使多糖更加容易溶出,因此得率在2 min以前有上升趨勢并在2 min時取得最大值。微波處理時間超過2 min,細(xì)胞中多糖幾乎全部溶出,得率增加不明顯[15]。綜合考慮浸提時間、消耗能量以及減少原料浪費等因素,因此選擇適宜微波處理時間為2 min左右。

圖2 微波時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the yield of polysaccharides

2.1.3 超聲波時間對多糖得率的影響 由圖3可知,多糖得率隨超聲波時間的延長呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,在超聲處理15 min時,多糖得率達(dá)到最大為27.6%。由于較短時間內(nèi),超聲開始對細(xì)胞進(jìn)行破碎,多糖得以釋放,隨著超聲時間的增長,多糖破壞為單糖,同時超聲波空化效應(yīng)作用力減小,使黃秋葵顆粒表面對多糖吸附力增加,影響多糖析出[16]。因此選擇適宜超聲波時間為15 min左右。

圖3 超聲波時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides

2.1.4 超聲波功率對多糖得率的影響 由圖4可知,隨著超聲波功率的增大呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,700 W時多糖得率最大為27.49%。隨著超聲功率的增加超聲的空化作用隨之加強(qiáng),細(xì)胞充分破裂多糖加速溶出;當(dāng)超聲波功率過大時,可能會引起局部溶液瞬時升溫,使多糖分子鏈裂解,多糖得率有所降低[16]。因此選擇適宜超聲波功率為700 W左右。

圖4 超聲波功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

2.2 BBD實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 BBD實驗設(shè)計方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,由SPSS 18.0軟件方差分析得,除料液比對得率影響不顯著外(p>0.05),其余各因素對多糖得率存在顯著影響(p<0.05),因此選用微波時間、超聲波時間、超聲波功率三個因素進(jìn)行響應(yīng)面處理獲得最優(yōu)條件。由Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件設(shè)計三因素三水平實驗,通過Box-Behnken實驗設(shè)計出17個實驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及多糖得率Table 2 RSM design and polysaccharides yield

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.5對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,結(jié)果見表3。得到回歸方程:

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

Y=27.47+0.16A-0.28B+1.27C+0.40AB+0.015AC-0.020BC-1.13A2-0.69B2-1.39C2

回歸模型的顯著水平不高,模型顯著(p<0.05),失擬項是用來評估方程可靠性的重要依據(jù),本實驗失擬項F值為0.25,p值為0.8550>0.05,說明該模型失擬項不顯著,能對相關(guān)反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測。信噪比為5.077>4,表明該模型擬合度和可信度都較高。

因此不同提取條件下黃秋葵超微粉中多糖得率的變化可用此模型方程來預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面圖分析 根據(jù)回歸模型,將任一因素固定在零水平,能夠得到反映另外2個因素及其交互作用影響的響應(yīng)曲面和等高線圖,結(jié)果如圖5。

由圖5及表3可知,模型中的C(超聲波功率)和C2(超聲波功率二次項)對黃秋葵超微粉中多糖得率有極顯著影響,A2(微波時間二次項)對黃秋葵超微粉中多糖得率有顯著影響,而在微波時間和超聲波時間、微波時間和超聲波功率以及超聲波時間和超聲波功率的相互作用下,對黃秋葵超微粉中多糖得率影響不顯著。綜合各圖表數(shù)據(jù)所得,這3個因素對黃秋葵超微粉中多糖得率的影響大小順序為超聲波功率>超聲波時間>微波時間。

圖5 兩因素的交互作用對多糖得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of two factors on the yield of polysaccharides

2.2.4 黃秋葵超微粉多糖提取工藝條件的確定與驗證 依據(jù)回歸模型經(jīng)過Design-Expert 8.0.5軟件分析得到黃秋葵超微粉中多糖提取的最佳提取工藝參數(shù)為:微波時間2.04 min、超聲波時間14.01 min、超聲波功率791.70 W。在此條件下,黃秋葵超微粉中多糖得率的預(yù)測值為27.7963%。聯(lián)系現(xiàn)實考慮節(jié)能問題對上述條件進(jìn)行修正,最終的優(yōu)化條件為微波時間2 min、超聲波時間14 min、超聲波功率800 W。采用上述優(yōu)化提取條件重復(fù)實驗3次,經(jīng)驗證,得到的平均得率為27.68%,與理論預(yù)測值27.7963%相比差0.42%,相對誤差較小,說明該模型能較好的預(yù)測實際得率。

2.3 黃秋葵超微粉中多糖的抗氧化活性分析結(jié)果

由Excel 2007作樣品濃度關(guān)于自由基清除率二次線性方程,當(dāng)清除率為50%時計算所需樣品濃度得IC50,其中y表示自由基清除率,x表示樣品濃度。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 如圖6,黃秋葵超微粉多糖對DPPH自由基的清除率隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)。濃度在1～2 mg/mL范圍內(nèi),清除率增加趨勢較快,多糖液濃度為2 mg/mL時,清除率是58.4%,2～5 mg/mL范圍內(nèi),清除率增加放緩,當(dāng)多糖液的濃度達(dá)到5 mg/mL時,其DPPH自由基清除率達(dá)到了92.0%,其IC50值為1.53 mg/mL,根據(jù)表4可知,在四個自由基清除體系中,DPPH自由基清除體系中的IC50值最小,說明相比較其它三種自由基,DPPH自由基的清除率在50%時所需多糖溶液濃度最低,因此多糖在DPPH自由基清除體系中的抗氧化能力表現(xiàn)最好。

表4 黃秋葵超微粉多糖清除自由基 IC50值Table 4 Scavenging free radical IC50 value of polysaccharides from superfine powder of okra

圖6 黃秋葵超微粉多糖對DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radicals of polysaccharides from superfine powder of okra

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力 如圖7,隨著多糖濃度的增加,對超氧陰離子自由基的清除率隨之增加。在1～3 mg/mL范圍里,增加較為快速,在3～5 mg/mL范圍內(nèi),超氧陰離子自由基清除率增加緩慢。當(dāng)濃度為5 mg/mL,超氧陰離子自由基清除率是44.2%。其IC50值為4.12 mg/mL。

圖7 黃秋葵超微粉多糖對超氧陰離子自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of of polysaccharides from superfine powder of okra

2.3.3 羥自由基清除能力 如圖8,隨著多糖濃度的增加,對羥自由基的清除率隨之增加。在1～3 mg/mL范圍里,增加較為快速,在3～5 mg/mL范圍內(nèi),羥自由基清除率增加緩慢。當(dāng)濃度為5 mg/mL,羥自由基清除率49.2%。其IC50值為6.38 mg/mL。

圖8 黃秋葵超微粉多糖對羥自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of ·OH of polysaccharides from superfine powder of okra

2.3.4 還原力的測定 由圖9可得,黃秋葵超微粉多糖具有較強(qiáng)的還原力,隨著多糖濃度的增加其還原力越強(qiáng)。在1～5 mg/mL范圍內(nèi)增長趨勢接近于線性增加。在5 mg/mL時,多糖還原力高達(dá)0.995。其IC50值為2.49 mg/mL。

圖9 黃秋葵超微粉多糖的還原力測定Fig.9 Determination of reducing force of polysaccharides from superfine powder of okra

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對黃秋葵超微粉多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了黃秋葵超微粉多糖得率與微波時間、超聲波時間、超聲波功率這三種因素的二次多項回歸模型。由該模型優(yōu)化的多糖提取條件為料液比1∶100 (g∶mL)、微波時間2 min、超聲波時間14 min、超聲波功率800 W。經(jīng)驗證,得到的實際測定值為(27.68%±0.42%)。說明該模型能較好的預(yù)測實際得率,用響應(yīng)面法對黃秋葵超微粉中多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化準(zhǔn)確可行。抗氧化活性實驗表明黃秋葵超微粉多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基均有一定的清除能力并且具有較強(qiáng)的還原能力。多糖在四種體系中的IC50值分別是1.53、4.12、6.38和2.49 mg/mL,說明黃秋葵超微粉多糖具有較好的抗氧化活性。

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