發(fā)酵法制取刺梨果渣膳食纖維工藝優(yōu)化及其特性分析

丁小娟,孟 滿,趙澤偉,顧苑婷,丁筑紅

(貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)系薔薇科薔薇屬落葉灌木,因其果形似梨且表面密生小肉刺,故稱刺梨,原產(chǎn)于我國西南部[1]。以刺梨為原料的產(chǎn)品有飲料[2]、果醋[3]、保健品[4-5]、藥品[6-7]等。膳食纖維具有抗癌、抗氧化、降低膽固醇、改善胃腸健康、預(yù)防心血管疾病等作用[8-11]。刺梨加工利用方面多以生產(chǎn)刺梨果汁為主,而其花、葉、果肉、籽的營養(yǎng)及藥用價值綜合利用率低,刺梨果榨汁產(chǎn)生40%～50%的皮渣資源被嚴重浪費[12]。

目前,對刺梨營養(yǎng)成分及加工利用的研究報道較多,而利用混合菌種發(fā)酵刺梨果渣制備膳食纖維方面的研究鮮有報道。已被報道的混合發(fā)酵菌種有乳桿菌和雙歧桿菌[13]、黑曲霉和枯草芽孢桿菌[14]、乳酸菌和綠色木霉[15]、米根霉、里氏木霉和黑曲霉[16]、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)[17]等。本實驗以刺梨果渣為原料,利用前期篩選的嗜酸乳桿菌(GIM.1.208)、戊糖乳桿菌(CICC.22210)和生香酵母(Aroma-producing yeast)混合發(fā)酵,以期提高刺梨果渣總膳食纖維(TDF)含量,從而提高刺梨果渣膳食纖維利用率,為制備刺梨果渣SDF的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺梨果渣 貴州龍里所提供的刺梨(貴農(nóng)5號品種)，榨汁后去汁留渣,裝入保鮮袋中密封保存于4 ℃的冰箱,備用；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)GIM.1.208、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)CICC.22210 貴州輕化工中心;生香活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶 Megazyme International Ireland,Bray Business Park;2-(N-嗎啡啉)乙磺酸/MES 上海源葉生物科技有限公司;TRIS 北京索萊寶科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基 蛋白胨10.0 g,牛肉膏10.0 g,酵母粉5.0 g,葡萄糖5.0 g,乙酸鈉5.0 g,檸檬酸鈉0.05 g,吐溫80 1.0 mL,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·7H2O 0.05 g,碳酸鈣20.0 g,瓊脂(1.5 g/100 mL),蒸餾水1000 mL,自然pH,121 ℃,0.1 MPa滅菌30 min,置于37 ℃培養(yǎng)24～48 h,用于乳酸菌擴大及斜面菌種培養(yǎng)。

立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;SPX-150BⅢ型生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;GDE+CSF6膳食纖維測定儀 意大利VELP SCIENTIFICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 刺梨鮮渣→按料液比加水→滅菌→接種菌種→發(fā)酵培養(yǎng)→烘干(60 ℃)→粉碎(過60目篩)→膳食纖維測定

500 mL三角瓶中添加50 g刺梨果渣,按料液比1∶5 g/mL加入蒸餾水,用棉塞塞緊瓶口,煮沸滅菌10 min,待其冷卻后于無菌操作臺分別接入活化酵母菌與乳酸菌擴大培養(yǎng)的種子液,在自然pH條件下,將發(fā)酵液置于生化培養(yǎng)箱動態(tài)觀察測定相關(guān)理化指標。

1.2.2 菌種的培養(yǎng) 生香酵母菌活化參照文獻[18]并改進如下:在酵母菌中按質(zhì)量比1∶20的量加入30 ℃蒸餾水,使其均勻分散,加入5%蔗糖,同時使水溫保持在35～40 ℃,活化20～30 min。取出后待菌液降至室溫進行接種。乳酸菌活化:MRS活化培養(yǎng)液121 ℃,0.1 MPa滅菌30 min,分別接入嗜酸乳桿菌GIM.1.208、戊糖乳桿菌CICC.22210乳酸菌的保藏培養(yǎng)物,37 ℃靜止培養(yǎng)24～48 h備用。

1.2.3 單菌種發(fā)酵 嗜酸乳桿菌GIM.1.208、戊糖乳桿菌CICC.22210:發(fā)酵溫度37 ℃;生香酵母:發(fā)酵溫度28 ℃;分別以接種量10%、料液比1∶5、發(fā)酵48 h,分析膳食纖維組成含量。

1.2.4 混合菌種發(fā)酵 GIM.1.208/CICC.22210/生香酵母=1∶2∶1、1∶1∶2、2∶2∶1、2∶1∶2,接種量10%,發(fā)酵溫度30 ℃和料液比1∶5 g/mL,分別用以上混合后的菌種發(fā)酵48 h,分析膳食纖維組成含量。

1.2.4.1 發(fā)酵溫度對刺梨果渣膳食纖維的影響 稱取25 g刺梨果渣置于250 mL三角瓶中,按料液比1∶5 g/mL,混菌比例1∶2∶1接種菌(接種量10%),控制發(fā)酵溫度分別為28、30、32、34、36 ℃,發(fā)酵48 h,測定膳食纖維組分含量。

1.2.4.2 發(fā)酵時間對刺梨果渣膳食纖維的影響 稱取25 g刺梨果渣置于250 mL三角瓶中,按料液比1∶5 g/mL,混菌比例1∶2∶1接種菌(接種量10%),發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60 h,發(fā)酵溫度30 ℃,測定膳食纖維組分含量。

1.2.4.3 料液比對刺梨果渣膳食纖維的影響 稱取25 g刺梨果渣置于250 mL三角瓶中,料液比分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 g/mL,混菌比例1∶2∶1接種菌(接種量10%),溫度30 ℃,發(fā)酵48 h,測定膳食纖維組分含量。

1.2.4.4 接種量對刺梨果渣膳食纖維的影響 分別稱取相同質(zhì)量的刺梨果渣置于三角瓶中,按料液比1∶5 g/mL,按混菌比例1∶2∶1分別接種6%、7%、8%、9%、10%,30 ℃發(fā)酵48 h,測定膳食纖維組分含量。

1.2.5 Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,每個因素選取三個對膳食纖維得率影響較大的水平,建立四因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗,以膳食纖維得率為響應(yīng)值,各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼,見表1。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.6 測定方法

1.2.6.1 膳食纖維的測定 總膳食纖維(TDF)的測定:參照GB5009.88-2014;不可溶性膳食纖維(IDF)的測定:參照GB5009.88-2014;可溶性膳食纖維(SDF):SDF=(TDF-IDF)×100,其中100表示100 g樣品中膳食纖維的百分含量。

1.2.6.2 膨脹力的測定 稱取樣品1.0000 g(m1),置于20 mL量筒中記錄體積(V1),加入 10.00 mL蒸餾水(移液槍準確吸取)。充分搖勻后靜置(24 h),記錄膳食纖維膨脹增長后的體積(V2),膨脹力(mL/g)=(V2-V1)/m1。

1.2.6.3 持水力的測定 稱取樣品1.0000 g(n1),置于 100 mL 燒杯中,加蒸餾水75 mL,在(25±2) ℃下攪拌24 h,轉(zhuǎn)移至離心杯中,設(shè)置1000 r/min,離心30 min,傾掉上清液,沉淀稱重(n2:精確到0.0001),持水力(g/g)=(n2-n1)/n1。

1.2.6.4 持油力的測定 參考Sangnark[19]的方法,稱取樣品1 g(h1:精確到0.0001),置于離心管中,加入適量豆油,室溫下靜置1 h。用已知重量的尼龍網(wǎng)/布(h2:精確到0.0001)過濾收集沉淀,稱取沉淀濕重(h3:精確到0.0001),持油力(g/g)=(h3-h2-h1)/h1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵對刺梨果渣膳食纖維的影響

由圖1可知,嗜酸乳桿菌1.208 SDF得率較高,達11.00%。與單一菌種相比,混合菌種A∶2B∶C發(fā)酵后果渣中SDF含量有所提高,不同比例混合菌種發(fā)酵果渣中SDF與TDF的得率顯著不同(p<0.05)。結(jié)果顯示刺梨果渣SDF得率發(fā)酵結(jié)果由大到小為:混菌比例1∶2∶1>嗜酸乳桿菌1.208>混菌比例2∶2∶1>混菌比例2∶1∶2>混菌比例1∶1∶2>戊糖乳桿菌22210>生香活性干酵母。雖然嗜酸乳桿菌1.208與混菌1∶2∶1差異不顯著,但研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌與戊糖乳桿菌在特定條件下可產(chǎn)β-葡萄糖苷酶系,對膳食纖維有一定的降解作用。因此確定最優(yōu)菌種為1∶2∶1,在此條件下,發(fā)酵效果最佳,果渣培養(yǎng)物中TDF、IDF及SDF的得率分別為52.80%、41.34% 和11.46%。

圖1 不同菌種對膳食纖維的影響Fig.1 Influence of different strains on dietary fiber注:不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

相關(guān)研究表明,嗜酸乳桿菌與戊糖乳桿菌在特定發(fā)酵條件下有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶系的功能,對膳食纖維有一定的降解作用[20]。菌株生長時利用原料中的淀粉、蛋白質(zhì),提高DF純度,其產(chǎn)生的有機酸可斷裂纖維素類大分子的糖苷鍵,降低纖維的聚合度,將部分IDF轉(zhuǎn)化成可溶性多糖,提高SDF含量和產(chǎn)品的生理活性[21]。生香酵母具有獨特產(chǎn)香特性[22-23]。因此,確定混菌(GIM.1.208∶CICC.22210∶生香酵母)比例1∶2∶1為發(fā)酵菌種。

2.2 混合菌種發(fā)酵條件的研究

2.2.1 不同發(fā)酵溫度對刺梨果渣膳食纖維的影響 由圖2可知,30 ℃時TDF得率最高達11.43%,當溫度超過32 ℃時,TDF制取率隨溫度升高而減小;SDF得率在30 ℃時達到最大值,36 ℃時達到最小值,可能是處理時間過長會造成SDF結(jié)構(gòu)的改變,被分解成更小的結(jié)構(gòu),造成部分SDF損失[24];溫度超過菌體最適生長溫度,抑制菌種生長,不利于發(fā)酵的充分進行[25]。因此,確定最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對膳食纖維的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on dietary fiber

2.2.2 不同發(fā)酵時間對刺梨果渣膳食纖維的影響 由圖3可知,12～24 h時TDF得率呈下降趨勢,24 h后呈上升趨勢,48 h達最大;隨著發(fā)酵時間的延長,SDF得率呈上升趨勢,48 h達最大,48 h后SDF得率顯著下降。可能是由于隨時間增加使果膠裂解,并在水中被氫離子水解[24];后期由于菌種增長使發(fā)酵產(chǎn)物不斷積累,體系pH持續(xù)下降,抑制菌體自身生長或產(chǎn)生菌體自溶,使菌體產(chǎn)酶效果下降進而導致發(fā)酵動力下降[26-27]。周笑犁等[28]用發(fā)酵法制備刺梨SDF最佳發(fā)酵時間為48 h,與本實驗結(jié)果一致。因此,確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

圖3 發(fā)酵時間對膳食纖維的影響Fig.3 Influence of fermentation time on dietary fiber

2.2.3 不同料液比對刺梨果渣膳食纖維的影響 由圖4可知,TDF得率無明顯變化;而隨著料液比的增加,SDF得率在料液比為1∶5 (g/mL)時,SDF得率達到最大,之后SDF得率呈下降趨勢。料液比過大或過小都不利于乳酸菌與酵母混合菌體產(chǎn)酶代謝，進而影響SDF得率及刺梨果渣培養(yǎng)物的品質(zhì)。因此,確定最佳料液比為1∶5 (g/mL)。

圖4 不同料液比對膳食纖維的影響Fig.4 Influence of different material liquid ratio on dietary fiber

2.2.4 不同接種量對刺梨果渣發(fā)酵膳食纖維的影響 由圖5可知,接種量為10%時,TDF得率較高，SDF得率有最大值,之后逐漸下降。原因可能是接種量過大會使菌種數(shù)量增多,消化分解快速結(jié)束,導致后期發(fā)酵動力不足,SDF得率下降[29]。因此,確定10%接種量較適宜。

圖5 不同接種量對膳食纖維的影響Fig.5 Influence of different inoculation quantity on dietary fiber

2.3 可溶性膳食纖維提取工藝回歸模型的建立及方差分析

響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨果渣中SDF提取的結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.06軟件,選用Box-Behnken模型,對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析,得到回歸方程:

表2 Box-Behnken實驗方案與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and result

Y=11.52+0.026A+0.27B+0.25C+0.15D+0.29AB+0.030AC-0.27AD-0.12BC+0.085BD+0.25CD-0.75A2-0.78B2-0.56C2-0.36D2

模型的方差分析結(jié)果見表3。模型p<0.0001,模型極為顯著，所選模型可靠。失擬項p=0.0852>0.05,差異不顯著,方程對實驗擬合程度較好。模型相關(guān)系數(shù)是0.9414,說明該模型能揭示94.14%的響應(yīng)值變化。對回歸方程系數(shù)進行顯著性檢驗(表3),表明一次項B、C及二次項A2、B2、C2、D2因素各水平間均對SDF得率有極顯著影響(p<0.01);一次項D及交互項AB、AD、CD對SDF得率有顯著影響(p<0.05),其余對SDF得率影響不顯著(p>0.05)。

表3 響應(yīng)面分析實驗方差分析結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

2.4 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

考察交互項對提取率的影響,由圖6～圖11可知,當溫度和時間一定時,隨料液比的增大,SDF得率先增大后減小;隨接種量的增大,SDF得率先增大后減小;兩因素之間的交互作用對SDF得率的影響顯著。當接種量和時間一定時,隨溫度的升高,SDF得率逐漸增大;隨料液比的增大,SDF得率先增大后減小;兩因素間的交互作用不顯著。當溫度和接種量一定時,隨料液比的增大,SDF得率逐漸增大;隨時間的增加,SDF得率逐漸增大;兩因素間的交互作用對SDF得率影響顯著。當時間和料液比一定時,隨溫度的降低,SDF得率先增大后減小;隨接種量的增大,SDF得率先增大后減小;兩因素間交互作用不顯著。當料液比和溫度一定時,隨接種量的增加,SDF得率先增大后減小;隨時間的增加,SDF得率先增大后緩慢減小;兩因素間的交互作用不顯著。當料液比和接種量一定時,隨溫度的升高,SDF先增大后減小;隨時間的延長,SDF得率先增大后減小;兩因素間交互作用顯著。該結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖6 料液比和接種量對SDF得率的影響Fig.6 Influence of material liquid ratio and inoculation quantity on SDF yield

圖7 料液比和發(fā)酵溫度對SDF得率的影響Fig.7 Influence of material liquid ratio and fermentation time on SDF yield

圖8 料液比和發(fā)酵時間對SDF得率的影響Fig.8 Influence of material liquid ratio and time on SDF yield

圖9 接種量和發(fā)酵溫度對SDF得率的影響Fig.9 Influence of inoculation quantity and temperature on SDF yield

圖10 接種量和發(fā)酵時間對SDF得率的影響Fig.10 The influence of inoculation quantity and fermentation time on SDF yield

圖11 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對SDF得率的影響Fig.11 The influence of fermentation time and temperature on SDF yield

經(jīng)Design-Expert 8.06軟件分析優(yōu)化,得到發(fā)酵法制取刺梨果渣SDF最佳工藝參數(shù)為混合菌種(嗜酸乳桿菌GIM.1.208∶戊糖乳桿菌CICC.22210∶生香酵母)比例1∶2∶1、料液比1∶5 (g/mL)、接種量10.34%、溫度30.55 ℃、時間51.89 h,此條件下SDF得率理論上是11.599%。根據(jù)實際將發(fā)酵條件調(diào)整為:料液比1∶5 (g/mL)、接種量10%、溫度30 ℃、時間52 h,所得結(jié)果為11.590%,與理論值相差0.009,相對誤差0.08%,實測值與理論值相差不顯著,說明實驗結(jié)果與模型擬合較好,建立此模型能夠真實的反映各因素對SDF得率的影響,通過該模型優(yōu)化能有效提高SDF得率。

2.5 發(fā)酵前后果渣特性分析

由表4可知,新鮮刺梨果渣中TDF含量達55.46%,SDF含量約為2.72%,可見刺梨果渣是獲取膳食纖維的良好資源。發(fā)酵后刺梨果渣中SDF較原果渣高,其中SDF含量達11.59%,較原果渣提高76.53%。表明由于微生物的消化分解作用,消耗大部分營養(yǎng)物質(zhì),促使膳食纖維的含量顯著提高[20]。乳酸菌是人類腸道中的益生菌[31],生香酵母具有獨特的產(chǎn)香特性[32],經(jīng)發(fā)酵處理后刺梨果渣膳食纖維理化性質(zhì)得到改善,膨脹力和持水力分別為14.65 mL/g和16.71 g/g,不飽和脂肪和飽和脂肪持油力分別為4.54 g/g和2.12 g/g。蔣麗[15]采用乳酸菌和綠色木霉菌混合菌種為發(fā)酵劑,從檸檬果渣中提取膳食纖維膨脹力和持水力分別為13.21 mL/g和9.15 g/g,楊雪[30]發(fā)酵柑橘皮渣制備膳食纖維的持水力為7.21 g/g,膨脹力為9.65 mL/g,本研究結(jié)果均優(yōu)于上述報道結(jié)果,表明發(fā)酵法處理果渣對膳食纖維理化特性中膨脹力、持水力和持油力的影響顯著。

表4 發(fā)酵前后果渣特性分析Table 4 Comparision of character analysis before and after fermentation of pomace

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對刺梨果渣膳食纖維提取條件進行優(yōu)化,建立膳食纖維得率的回歸模型,由該模型優(yōu)化的膳食纖維提取條件為:混合菌種嗜酸乳桿菌(GIM.1.208)、戊糖乳桿菌(CICC.22210)和生香酵母(Aroma-producing yeast)比例1∶2∶1、料液比1∶5、接種量10%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間52 h,此條件下,刺梨果渣膳食纖維的平均得率為11.590%。高品質(zhì)膳食纖維持水力不小于7 g/g,膨脹力應(yīng)大于10 mL/g[16],本實驗制備的水溶性膳食纖維持水力和膨脹力分別達到16.71 g/g、14.65 mL/g,符合高質(zhì)量膳食纖維的要求。

刺梨果渣作為一種質(zhì)優(yōu)價廉的膳食纖維資源,利用混合菌種發(fā)酵不僅提高了SDF得率,而且可改善膳食纖維特性。且該法發(fā)酵時間短,操作簡便,為推動刺梨果渣資源的充分利用,開發(fā)新型膳食纖維產(chǎn)品提供了實驗基礎(chǔ)。

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