兩種假單胞桿菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶優(yōu)化和酶性質(zhì)研究

王 僑，秦正山，袁 濤，劉 通，王 單，邱會東

（重慶科技學(xué)院，重慶401331）

微生物脂肪酶種類多、來源廣、周期短、具有比動植物脂肪酶更廣的pH值和溫度范圍，具有較高的催化活性、穩(wěn)定性和專一性，可在有機相中進行催化反應(yīng)，易于工業(yè)化等優(yōu)點[1]，在有機合成、洗滌劑、食品加工等諸多領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛開發(fā)利用[2]，是一類重要的工業(yè)酶[3]。

張謙等[3]利用黑曲霉針對于G62s搖瓶發(fā)酵條件來產(chǎn)脂肪酶，對培養(yǎng)條件的優(yōu)化后提高了菌株脂肪酶產(chǎn)量；Ma R.J.等[4]對自枯草芽孢桿菌168的編碼LipA的基因在PNA和PAE啟動子的控制下在BNA中表達，使菌株BNACL和BNAAL的胞外脂酶活性進一步增強，來產(chǎn)高活性的脂肪酶；郭曉軍等[5]從富含油脂的土樣中篩選芽孢桿菌菌株產(chǎn)脂肪酶；Zin等[6]利用酸預(yù)處理的椰子渣發(fā)酵和相容性的洗滌劑作為芽孢桿菌（Bacillus spratosphericus）底物，從而生產(chǎn)脂肪酶；符小燕等[7]用葡萄球菌經(jīng)過微波和紫外單獨誘變、微波復(fù)合紫外和紫外疊加誘變,經(jīng)初篩和復(fù)篩,獲得產(chǎn)脂肪酶活力較高的菌種來產(chǎn)脂肪酶,優(yōu)化條件后獲得的最高酶活為17.54 U/mL；蔣琰潔等[9]對酵母菌的分離和篩選,在最優(yōu)條件下發(fā)酵獲得脂肪酶；王旭愿等[10]采用Rashid N p-nPP比色法,通過單因素試驗和正交試驗對洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基主要成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以提高聚丁二酸丁二醇酯（PBS）的生物降解速率，結(jié)果表明：在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下,洋蔥假單胞菌產(chǎn)脂肪酶活性可達32.935 U/mL；李楠等[11]采用耐冷假單胞菌Pseudomonassp.G6產(chǎn)脂肪酶，對其條件優(yōu)化，最后產(chǎn)酶能達到最大值，為65.66 U/mL。相對來說，假單胞菌具有現(xiàn)有微生物中豐富的酶庫，而且假單胞菌擁有的酶庫中有一類酶-II肪酶由于其具有高立體選擇性、底物專一性、位置選擇性和較高的轉(zhuǎn)酯活性[12-15]，廣泛應(yīng)用于食品加工、藥物合成、手性拆分、生物能源[16-21]等各個領(lǐng)域，是理論和應(yīng)用研究的熱點。

尹利[22]采用了單因子實驗篩選出產(chǎn)酶的最適碳源和氮源的方法，對洋蔥進行假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶，胡靜[23]利用驗室篩選得到的假單胞菌Pseudomonas oleovoransZJ03菌株,采用紫外誘變結(jié)合Nile Red隨機定向篩選的方法高產(chǎn)PHA菌株,發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶。蘇鳳宜等[24]利用季銨鹽陽離子表面活性劑重點研究十二烷基三甲基溴化銨，DTAB制備P.Putida mt-2的休止細胞，并考察表面活性劑對惡臭假單胞菌胞內(nèi)酶活的影響等方法，在最優(yōu)條件下生產(chǎn)脂肪酶。

目前，研究單一的假單胞桿菌產(chǎn)脂肪酶的較多，忽略了菌種協(xié)同作用產(chǎn)脂肪酶的能力，本研究由此選取假單胞菌種中具有代表性的熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌作為研究對象，對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，提高其發(fā)酵產(chǎn)酶量，摸索該脂肪酶提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

菌種：熒光假單胞菌凍干粉（GIMCC1.110)。

試劑及耗材：橄欖油；聚乙烯醇；羅丹明B；葡萄糖；α-乳糖；瓊脂；綠膿桿菌凍干粉(GIMCC1.22)；LB固體培養(yǎng)基；牛肉膏；甘油（≥99%），其他試劑均為市售分析純，如無水乙醇、NaOH、氯仿、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaHCO3、酚酞；吐溫-80等。

1.2 培養(yǎng)基的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏20 g，蛋白胨15 g，氯化鈉15 g，α-乳化糖5 g，吐溫-80 3%溶于1000 mL蒸餾水中，pH值自然，滅菌備用。

LB固體培養(yǎng)基：40 g LB固體培養(yǎng)基溶于1000 mL蒸餾水中，滅菌備用。

酶活檢測平板：橄欖油乳化液1.2 mL，羅丹明B 0.002%，瓊脂1.5，pH值自然。

橄欖油乳化液：取橄欖油與聚乙烯醇溶液按l∶3比例混合，用高速乳化機乳化3次，每次5 min，4℃保存。

1.3 菌種的活化

用接種環(huán)分別接種4份熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌菌體于LB斜面培養(yǎng)基的試管內(nèi)。第1份按照接種比例為熒光假單胞桿菌∶綠膿桿菌菌體（w∶w）1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5；第 2份接種比例為綠膿桿菌∶熒光假單胞桿菌菌體（w∶w）1∶1、1∶1.1、1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4、1∶1.5；第 3 份接種單一的熒光假單胞桿菌菌體；第4份接種單一的綠膿桿菌菌體；30℃，250 r/min培養(yǎng)12～16 h。取0.5 mL培養(yǎng)液，與等體積的30%無菌甘油溶液混合，-80℃保存。

1.4 發(fā)酵實驗

分別從4份甘油保存管中按照1%的接種量接種LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12～16 h，作為種子瓶。發(fā)酵瓶為250 mL三角瓶，裝液量30 mL。以接種量6%(v/v)的液體種子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃，150 r/min下發(fā)酵24 h，發(fā)酵液于4000 r/min下離心15 min獲得上清液，測定其脂肪酶酶活。

1.5 生長曲線的測定

按接種量為6%(v/v)取液體種子于含有發(fā)酵培養(yǎng)基（25 mL）的三角瓶中，以30℃、150 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)。于培養(yǎng)6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h時分別取樣，于4000 r/min離心15 min分別獲得上清液與沉淀，沉淀獲得菌體，并用pH計測定發(fā)酵液pH值。將菌體置于105℃烘箱中，失水至恒重，測菌體干重。測定其600 nm處的光吸收值，繪制(t)-OD600曲線。

1.6 活力的測定

1.6.1 脂肪酶活力的測定

取2支100 mL三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶(B)中各加PVA橄欖油乳化液4 mL和0.025 mol/L pH7.5磷酸緩沖液5 mL(應(yīng)把附在瓶壁上的乳化液沖下)，再于A瓶中加入95%乙醇15 mL。置于40℃水浴內(nèi)預(yù)熱5 min，然后在2個瓶中各加入酶液l mL立即記時，反應(yīng)15 min后，在B瓶中立即加入95%乙醇15 mL中止反應(yīng)，加酚酞指示劑3滴，用0.05 mol/L標準NaOH滴定至微紅色為終點，消耗的NaOH溶液分別為V1、V2。對照樣品的乙醇應(yīng)在酶液前加入[25]。

脂肪酶活力單位(U)定義為：在試驗條件下，每毫升酶液每分鐘催化底物釋放出1μmol的游離脂肪酸，定義為一個脂肪酶活力單位(U)，其計算公式如下：

式中：V樣——滴定至終點時樣品瓶中消耗的NaOH的體積，mL；

V空——滴定至終點時對照瓶中消耗的NaOH的體積，mL；

MNaOH——NaOH的摩爾濃度。

1.6.2 蛋白酶活力的測定

將含有0.9 mL pH7.2的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和l mL 2%酪蛋白的混合液50℃水浴中預(yù)熱15 min，加入0.1 mL待測樣品，精確反應(yīng)10 min，加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，靜置后以12000 r/min離心10 min，取上清液，用蒸餾水定容至10 mL，混勻后于紫外分光光度計275 nm測OD值?？瞻讓φ赵诩尤霕悠分跋燃? mL 0.4 mol/L的三氯乙酸的反應(yīng)體系，其余步驟相同。

酶活力單位定義(U)：在pH7.2、50℃的條件下每l min水解酪蛋白產(chǎn)生lμg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.7.1 初始pH值對菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

初始pH值作為微生物生存的外部環(huán)境之一，對其發(fā)酵也有一定的影響。用NaOH（0.1 mol/L）或HCl（0.1 mol/L）溶液，調(diào)整培養(yǎng)基的起始pH值為 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。發(fā)酵液于4000 r/min下離心15 min獲得上清液，測定脂肪酶活力。確定最佳pH值。其他條件不變，將最大脂肪酶活力設(shè)為100%。

1.7.2 發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

不同的發(fā)酵溫度對微生物生長及代謝產(chǎn)物的分泌有較大的影響。實驗按1.7.1中確定的最佳pH值配制發(fā)酵培養(yǎng)基，以最佳接種量接種培養(yǎng)基，分別于16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃條件下，150 r/min進行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)（培養(yǎng)時間為生長曲線測定時得到的時間）。收集發(fā)酵液，以4000 r/min離心15 min獲得上清液，分別測定脂肪酶活力。以未作處理的發(fā)酵上清液作為對照，酶活力設(shè)為100%，滴定法檢測酶活力。

1.7.3 金屬離子對酶活的影響

發(fā)酵液經(jīng)4000 r/min離心15 min，取上清液，用于測定酶活力。實驗組分別向緩沖液中添加相應(yīng)金屬離子(Cu2+：CuSO4·5H2O；Zn2+：ZnSO4·7H2O；Al3+：AlCl3·6H2O；K+：KCl；Mg2+：MgCl2·6H2O；Ca2+：CaCl2)，終濃度5 mM。對照組不添加金屬離子，并將其酶活力設(shè)為100%。

1.8 單因素正交試驗的優(yōu)化

對于碳源、氮源、表面活性劑和金屬離子實驗的結(jié)果，采用正交試驗對α-乳糖、蛋白胨、吐溫-80和CaCl2做4因素水平試驗，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.9 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇初始pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量這4個發(fā)酵影響因素，正交試驗發(fā)酵條件和因素水平見表2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長曲線的測定

以O(shè)D600光吸收值為指標指示菌體生長量。熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌菌株協(xié)同生長曲線如圖1所示。0～8 h為生長遲滯期，8～18 h為對數(shù)生長期，18 h之后進入穩(wěn)定期，至22 h時菌體濃度基本保持穩(wěn)定，略有下降。

2.2 培養(yǎng)基碳源對脂肪酶活力的影響

最適碳源的選擇：分別以8 g/L蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、麥芽糖、橄欖油、α-乳糖作為唯一碳源進行最適碳源的篩選，實驗結(jié)果見圖2。

在7種碳源中，利用α-乳糖作為唯一碳源，脂肪酶的產(chǎn)酶量最高，為28.7 U/mL。α-乳糖作為最佳碳源，可以有效降低代謝抑制，從而提高發(fā)酵液的酶活。麥芽糖也可以促進生長，但細菌利用麥芽糖作為唯一碳源生長的速度稍低于α-乳糖碳源。在相同條件下，以糊精作為唯一碳源，菌體總量偏少，影響產(chǎn)酶效果。

圖1 菌株生長曲線

圖2 不同碳源對產(chǎn)酶的影響

2.3 培養(yǎng)基氮源對脂肪酶活力的影響

分別以10 g/L的蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米漿、尿素、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、乙酸銨等9種有機氮源和無機氮源進行最適氮源的篩選，實驗結(jié)果見圖3。

以氯化銨、硫酸銨、乙酸銨作為唯一氮源進行發(fā)酵，脂肪酶的產(chǎn)酶量都較低，而玉米漿、牛肉膏、酵母粉等有機氮源脂肪酶的產(chǎn)量稍高，其中蛋白胨作為唯一氮源發(fā)酵，產(chǎn)酶效果最好，為28.3 U/mL。

2.4 接種比例對菌種協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酶活性的影響

菌種按照一定比例接種，接種比例過大并不利于菌體旺盛生長，因為消耗培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分多，代謝產(chǎn)物也多，不利于產(chǎn)酶，圖4為當綠膿桿菌比例為1時，變化熒光假單胞桿菌的比例；圖5為熒光假單胞桿菌比例為1時變化綠膿桿菌的比例。結(jié)果表明當熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌（w∶w）為1.3∶1或者為1∶1.1，此時的兩種菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)酶的活性最高。

圖3 不同氮源對產(chǎn)酶的影響

圖4 熒光假單胞桿菌接種比例變化與酶活性的影響

圖5 綠膿桿菌接種比例的變化與酶活性的影響

2.5 發(fā)酵周期的確定

以α-乳糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，并在不同發(fā)酵時間取樣，測定脂肪酶的酶活見圖6。

圖6 培養(yǎng)時間對發(fā)酵的影響

隨著培養(yǎng)時間的延長，脂肪酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在20 h達到峰值。在后續(xù)實驗中將發(fā)酵終點控制為20 h。

2.6 綠膿桿菌和熒光假單胞桿菌協(xié)同發(fā)酵時脂肪酶的基本性質(zhì)

2.6.1 最適溫度

不同溫度下檢測酶活力結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，隨著溫度的升高到32℃，相對酶活增大，高于32℃后相對酶活下降，在26～34℃之間，相對酶活在60%以上，在32℃時相對酶活最高，接近89.8%。

圖7 溫度對脂肪酶活力的影響

2.6.2 最適pH值

不同pH值條件下檢測酶活的結(jié)果見圖8。由圖8可以看出，該脂肪酶在pH7.5之前，隨著pH值升高，相對酶活增大，到7.5時相對酶活最高，達到89.6%，pH6.5～8.0之間，相對酶活保持在較高水平。當pH值大于7.5時，相對酶活開始下降，pH8.5明顯降低。初始pH值過高或過低都會使微生物的生命活動減弱，對產(chǎn)酶有顯著影響。

圖8 pH值對脂肪酶活力的影響

2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性

取30 mL酶液置于不同溫度下保存，每隔10 min取樣測定酶活性，結(jié)果見圖9，溫度在32℃時，酶活比較穩(wěn)定，在42℃和50℃時分別處理80 min，酶活僅損失13.6%、17.9%?？梢钥闯鲈?2～50℃假單胞桿菌協(xié)同發(fā)酵的脂肪酶酶活比較穩(wěn)定，酶活損失較小。

圖9 酶的熱穩(wěn)定性

2.6.4 pH值穩(wěn)定性

取30 mL酶液，加入等體積的不同pH值（pH5.5、6.5、7.5、8.5）的緩沖溶液，每隔10 min取樣測定酶活性，結(jié)果見圖10。在pH5.5～8.5熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同發(fā)酵的脂肪酶活性比較穩(wěn)定，其中偏堿性時更穩(wěn)定，pH7.5時，處理80 min，酶活力能維持在90%以上。

2.6.5 脂肪酶催化能力

圖10 酶的pH值穩(wěn)定性

對比a、b、c三者的脂肪酶催化合成單甘酯，將10 g棕櫚油和含一定量水的甘油2.5 g混合，加入適量脂肪酶，在各自最佳條件下進行反應(yīng)，實驗結(jié)果見圖11。熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酶獲得了最高的單甘酯含量，催化合成的單甘酯的效率是單一的熒光假單胞桿菌和單一綠膿桿菌的3.3倍和2.5倍，且具有較高的單位酶活性催化合成單甘酯能力，具有良好的應(yīng)用前景。

圖11 脂肪酶催化合成單甘酯

2.6.6 脂肪酶活性與蛋白酶活性的變化

檢測發(fā)酵液的脂肪酶活性和蛋白酶活性變化如圖12。蛋白酶活性在前12 h處于較低水平，18 h達到最高并持續(xù)至24 h。發(fā)酵后期脂肪酶活性有顯著的下降，而同時蛋白酶活性維持在較高的水平。在發(fā)酵18 h后，熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同發(fā)酵的脂肪酶產(chǎn)量有一個降低過程，由于熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同發(fā)酵，在發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的同時，很可能其中某種單獨的桿菌或者各自都分泌了蛋白酶進入發(fā)酵液，導(dǎo)致發(fā)酵過程中脂肪酶產(chǎn)量的降低。蛋白酶對脂肪酶的降解是發(fā)酵后期脂肪酶酶活下降的原因之一[29-30]，通過敲除蛋白酶基因、添加蛋白酶抑制劑等手段減少其對脂肪酶的降解，將可進一步提高脂肪酶產(chǎn)量。

圖12 脂肪酶活性與蛋白酶活性變化

2.7 表面活性劑對菌種產(chǎn)酶的影響

表面活性劑可以與細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，促使細胞壁的結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致其通透性增大，利于脂肪酶的分泌。在發(fā)酵液培養(yǎng)基中以8 g/L的α-乳糖為碳源，以10 g/L的蛋白胨為氮源，分別加入6%曲拉通X-100、吐溫-80、十二烷基磺酸鈉（SDS）、羧甲基纖維素（CMC）于150 r/min、30℃下培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)液中脂肪酶活性。

圖13 表面活性劑對脂肪酶活力的影響

由圖13可以看出，添加5-羧甲基纖維素低于不添加表面活性劑的培養(yǎng)液，說明5-羧甲基纖維素對菌種的生長或產(chǎn)酶有抑制作用，添加吐溫-80，可促進綠膿桿菌和熒光假單胞桿菌協(xié)同產(chǎn)酶，十二烷基磺酸鈉（SDS）的加入也對產(chǎn)酶有促進作用，但添加吐溫-80的效果最好。

2.8 金屬離子對脂肪酶活性的影響

不同的金屬離子對產(chǎn)酶也有影響。由圖14可以看出，Cu2+完全抑制脂肪酶活性，Zn2+對脂肪酶活性具有極大的抑制作用，K+和Mg2+對脂肪酶活性有一定的促進作用，Ca2+對脂肪酶的激活作用最大，酶活力為28.42 U/mL。

圖14 金屬離子對脂肪酶活性的影響

2.9 正交試驗的優(yōu)化（表3、表4）

表3 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同作用產(chǎn)酶的4個因素從大到小順序為α-乳糖、蛋白胨、吐溫-80、CaCl2。即作為碳源的α-乳糖對熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同作用產(chǎn)酶的活性影響最大，其次是蛋白胨，CaCl2的影響最小。最優(yōu)組合為A1B1C1D1，熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同產(chǎn)酶在最佳工藝條件下配制的培養(yǎng)基進行正交試驗，平行發(fā)酵液酶活均可達到（33.361±0.05）U/mL。因此發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)配制為：α-乳糖6 g/L、蛋白胨8 g/L、吐溫-80 1%、CaCl20.5 g/L、KH2PO46 g/L、MnSO40.3 g/L、NaCl 5 g/L。

表4 發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

通過發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果分析可知，影響熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同作用產(chǎn)酶活性大小的因素由大到小依次是d、a、c、b，即接種量對脂肪酶活性影響最大，培養(yǎng)溫度對酶活性影響最小，平行發(fā)酵液酶活最高可達到（33.424±0.05）U/mL，最優(yōu)組合為a2b2c1d1,因此，選擇脂肪酶活性最高的培養(yǎng)條件為接種量8%，培養(yǎng)溫度32℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，初始pH7.5。

3 結(jié)論

3.1 熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌最佳接種比例為（w∶w）為1.3∶1，最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件為α-乳糖6 g/L、蛋白胨8 g/L、吐溫-80 1%、CaCl20.5g/L 、KH2PO46 g/L、MnSO40.3 g/L、NaCl 5 g/L、接種量8%、初始pH7.5、培養(yǎng)溫度32℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，在最適發(fā)酵條件下，該菌株最大產(chǎn)酶酶活能達到（33.424±0.05）U/mL。

3.2 在32～50℃和pH5.5～8.5假單胞桿菌協(xié)同發(fā)酵的脂肪酶酶活比較穩(wěn)定，酶活損失較小。添加吐溫-80對產(chǎn)酶有促進作用，Cu2+和Zn2+對脂肪酶活性具有極大的抑制作用，Ca2+則對脂肪酶有一定的激活作用。

3.3 熒光假單胞桿菌和綠膿桿菌協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生的脂肪酶比單一的熒光假單胞桿菌和單一的綠膿桿菌得到了高于2倍的單甘酯產(chǎn)量，且具有較高的單位酶活性催化合成單甘酯能力，具有良好的應(yīng)用前景。

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