拉莫三嗪誘發(fā)皮膚不良反應(yīng)與TCRBV基因表達(dá)的相關(guān)性研究

晁麗娜 許賢瑞 王旭 李琪 劉美麗 張慶

癲癇(epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)常見病。應(yīng)用抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDs)有效控制癇性發(fā)作仍是目前癲癇治療的首選方法。癲癇患者個(gè)體化用藥及用藥安全性問題受到廣泛關(guān)注。AEDs種類繁多，其中，拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)與卡馬西平(carbamazepine，CBZ)、奧卡西平(oxcarbazepine，OXC)，苯巴比妥(phenobarbitone，PB)、苯妥英鈉(phenytoin，PHT)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上均具有苯環(huán)而被統(tǒng)稱為芳香族抗癲癇藥物(aromatic antiepileptic drugs，AAEDs)[1]。臨床實(shí)踐提示，AAEDs較其他AEDs更易誘發(fā)皮膚不良反應(yīng)(cutaneous adverse reactions，cADRs)[1]。cADRs已成為臨床停用或更換AAEDs的主要原因，給患者和醫(yī)生造成困擾[2]。目前，AAEDs誘發(fā)cADRs的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明?，F(xiàn)有的研究表明AAEDs誘發(fā)cADRs可能涉及特定的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)分子，藥物或其代謝產(chǎn)物和特異性T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的相互作用[3]。TCR是T細(xì)胞表面的受體分子，其作用是識別抗原和參與免疫應(yīng)答。不同的抗原刺激會引起TCR β鏈可變區(qū)(beta chain variable region，BV)基因(TCRBV基因)片段的限制性取用。對其他藥物(如青霉素、巴氨西林和對二苯胺)引起過敏反應(yīng)的研究證實(shí)：不同藥物引起過敏反應(yīng)時(shí)TCRBV基因表達(dá)譜出現(xiàn)差異[4-6]。基于上述情況，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究LTG激活T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答而誘發(fā)cADRs的可能致病機(jī)制，分析在LTG誘發(fā)的cADRs(LTG-cADRs)患者與LTG耐受者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中，TCRBV基因表達(dá)的差異，以期明確LTG-cADRs與TCRBV基因表達(dá)是否存在相關(guān)性。

1 對象和方法

1.1觀察對象本研究應(yīng)用巢式病例對照研究方法。選取2014-12—2016-12寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診確診為癲癇并口服LTG治療的患者為研究隊(duì)列，收集患者的臨床資料。癲癇患者服用LTG的起始劑量及增加劑量，均按照《中國藥典2010》關(guān)于LTG的相關(guān)說明內(nèi)容進(jìn)行，口服LTG的起始劑量均≤12.5 mg/d。依照Mockenhaupt M(2009)cADRs診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)[7]執(zhí)行。將隊(duì)列內(nèi)cADRs已治愈達(dá)6周以上的LTG-cADRs患者作為病例組。以年齡相差±3歲、性別和民族相同為原則，按照1︰1配對設(shè)計(jì)選取該隊(duì)列內(nèi)口服LTG時(shí)間大于12周而未出現(xiàn)cADRs者作為對照組。

本次共納入癲癇患者20例，其中病例組10例，對照組10例。(1)病例組：男6例、女4例，年齡17～56歲，平均年齡(34.50±13.71)歲?；颊咧袧h族7例，回族3例，1例有花粉過敏史。10例cARDs均為輕型的斑丘疹(maculopapular eruption，MPE)，無嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)者。10例中1例以6.25 mg/d的劑量口服LTG至第5天時(shí)發(fā)生cADRs，3例以12.5 mg/d口服LTG時(shí)發(fā)生cADRs，其余6例均以≥25 mg/d口服LTG時(shí)發(fā)生cADRs，發(fā)生cADRs距開始服用LTG的時(shí)間最長為60 d，最短為1 d，中位數(shù)為11.5 d，四分位數(shù)間距32.5 d。(2)對照組：年齡為19～53歲，平均年齡為(34.20±12.70)歲。

1.2主要試劑與儀器植物凝集素(PHA)及人外周血淋巴細(xì)胞分離液(北京Solarbio公司)，F(xiàn)BS(浙江天杭生物科技有限公司)，PBS(美國HyClone公司)，RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國gibco公司)，Recombinant Human IL-2(美國Pepro Tech公司)，LTG標(biāo)準(zhǔn)品(英國Glaxo Smith Kline公司)，總RNA提取試劑盒(北京天根公司)，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit及CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，2×TransStart?Tip Green qPCR Mix(北京全式金生物有限公司)，人干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素5(IL-5)及腫瘤壞死因子β(TNF-β)ELISA檢測試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司)，高速低溫離心機(jī)(德國HERMLE公司)，電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，25號細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，東勝龍PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃集團(tuán))，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(iCyeler iQ5)(美國BIO-RAD公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集：收集病例組和對照組新鮮全血，每例抽取2 mL血常規(guī)管(含EDTA)4管(共8 mL)，置于4℃冰箱保存，于4 h內(nèi)行PBMCs分離實(shí)驗(yàn)。

1.3.2PBMCs的分離：用無菌巴氏滴管從血常規(guī)管中取出8 mL新鮮全血，用PBS等體積稀釋。另取1支離心管，加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液4 mL。吸取等體積的稀釋血液平鋪于分離液液面上方，保持兩液面界面清晰。室溫下，以1000g離心30 min，吸取出全部白膜層，移入另一空白離心管中，加入10 mL的PBS，吹吸混勻，以250g離心10 min。棄去上清，加入5 mL的PBS，吹打30次重懸細(xì)胞后以250g離心10 min(重復(fù)此步驟洗滌細(xì)胞兩次)。棄上清，加入含有15%(體積分?jǐn)?shù))FBS的RPMI1640培養(yǎng)液1 mL，吹打重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.3.3PBMCs培養(yǎng)與干預(yù)：培養(yǎng)條件為：嚴(yán)格無菌操作，37℃恒溫培養(yǎng)，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2，飽和濕度。用臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行PBMCs活力檢測，若活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%或以上，吸取已重懸的PBMCs加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入含有15%(體積分?jǐn)?shù))FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。然后向細(xì)胞中加入已配制好的重組人IL-2溶液、PHA溶液和LTG溶液(終濃度分別為20 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)以促進(jìn)細(xì)胞增殖，吹打混勻后放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管中，以250g離心10 min，取細(xì)胞上清液保存至-20℃?zhèn)溆茫怨┖罄m(xù)ELISA法檢測細(xì)胞因子；取細(xì)胞沉淀后用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-qPCR)的SYBR GreenⅠ熒光染料法檢測TCRBV基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。

1.3.4ELISA法檢測LTG刺激PBMCs分泌IL-5、TNF-β及IFN-γ的情況：取出于-20 ℃冰箱保存的細(xì)胞上清液，常溫下均勻充分解凍待測樣品，按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作，采用雙抗體一步夾心ELISA法檢測IFN-γ、IL-5及TNF-β的分泌量。測定450 nm波長下每孔吸光度〔D(λ)〕，記取3個(gè)復(fù)孔的平均值。用CurverExpert1.4軟件，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0、50、100、200、400、800 pg/mL)為x軸，以所測得的D(λ)值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，列出曲線方程后計(jì)算細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的濃度值(μg/mL)，以此濃度值×5(稀釋倍數(shù))計(jì)算樣本實(shí)際濃度。

1.3.5TCRBV基因檢測：(1)引物設(shè)計(jì)：登陸NCBI，在Genebank中查詢?nèi)薚CRBV基因(TCRBV1-TCRBV24)各序列，刪除TCRBV基因家族中的假基因，將其余18個(gè)基因序列(TCRBV2-TCRBV7、TCRBV9、TCRBV11-TCRBV20和TCRBV24)提供給上海生工公司設(shè)計(jì)合成引物，引物序列見下表1。

(2)總RNA的提取、cDNA第一鏈的合成：按照北京天根公司總RNA提取試劑盒的說明提取PBMCs的總RNA，用酶標(biāo)儀測定RNA的濃度及純度測定，D(λ)260/D(λ)280比值為1.8～2.0之間說明RNA純度高。將用于第一鏈cDNA合成時(shí)的總RNA定量為100 ng，依據(jù)每例樣本所測總RNA的濃度，計(jì)算RNA實(shí)際加樣的體積量，設(shè)置反應(yīng)體系行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反應(yīng)體系為：總RNA 100 ng，Oligo(dT)18 primer 1 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，ReverTAid M-MuLV RT(200 U/μL) 1 μL，以無核酸酶純水(nuclease-free water)補(bǔ)齊至20 μL?；靹虿㈦x心，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃ 60 min、70℃ 5 min后終止反應(yīng)。將cDNA于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3) RT-qPCR檢測病例組和對照組TCRBV基因的表達(dá)：以制備好的cDNA為模板、選擇GAPDH作為內(nèi)參對照，每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，行RT-PCR擴(kuò)增，用SYBR GreenⅠ熒光染料法檢測TCRBV基因的表達(dá)，其反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L) 0.4 μL，Reverse Primer(10 μmol/L) 0.4 μL，Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 8.2 μL，總體積20 μL。反應(yīng)條件為： 94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s；56 ℃ 15 s；72 ℃ 10 s，循環(huán)42次后終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，得到病例組與對照組TCRBV基因和GAPDH內(nèi)參的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，每一種顏色的曲線代表一種基因。用Excel2007整理擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(即Ct值)，采用2-ΔΔCt相對定量法計(jì)算兩組TCRBV基因的相對表達(dá)量，以2-ΔΔCt值作為相對表達(dá)量指標(biāo)進(jìn)行比較。兩組TCRBV基因的ΔCt值計(jì)算如下：ΔCt病例組=Ct病例組-CtGAPDH，ΔCt對照組=Ct對照組-CtGAPDH。ΔCt對照組平均值計(jì)算方法為：對照組3個(gè)復(fù)孔ΔCt之和，再除以3。兩組TCRBV基因的ΔΔCt值計(jì)算如下：ΔΔCt病例組=ΔCt病例組-ΔCt對照組平均值，ΔΔCt對照組=ΔCt對照組-ΔCt對照組平均值。

表1 TCBBV基因引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel(2007)和17.0版本的SPSS 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；兩樣本均數(shù)比較時(shí)，用t檢驗(yàn)(方差齊時(shí))或t’檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布者，數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距〔M(QR)〕表示，兩樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組PBMCs分泌IFN-γ、IL-5及TNF-β水平比較病例組IFN-γ水平明顯高于對照組(P<0.05)，IL-5和TNF-β水平略高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P> 0.05)，具體結(jié)果見表2。

表2 兩組IFN-γ、IL-5及TNF-β水平比較(n=10，±s，ng/mL)

注：IFN-γ：干擾素γ;IL-5：白細(xì)胞介素5；TNF-β：腫瘤壞死因子β

2.2兩組TCRBV基因表達(dá)水平比較

2.2.1TCRBV基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線：病例組與對照組TCRBV基因和GAPDH內(nèi)參的擴(kuò)增曲線(圖1)和熔解曲線(圖2)顯示：TCRBV基因擴(kuò)增曲線的基線平整并到達(dá)平臺期，且每個(gè)基因的熔解曲線峰形較單一，表明所設(shè)置的反應(yīng)條件準(zhǔn)確，在TCRBV基因的擴(kuò)增過程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2.2兩組TCRBV基因表達(dá)的差異：在兩組中差異表達(dá)的TCRBV基因有TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19(P< 0.05；表3)。依據(jù)這5個(gè)差異表達(dá)的基因在病例組與對照組中的秩和值可見：TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19在病例組中的表達(dá)量高于對照組(表4)。

圖 1 TCRBV與GAPDH基因的擴(kuò)增曲線

圖 2 TCRBV與GAPDH基因的熔解曲線

TCRBV基因病例組對照組Z值P值TCRBV21.02(1.38)0.88(0.83)-0.5030.615TCRBV30.89(1.39)0.92(1.10)-0.5170.605TCRBV40.98(0.60)1.06(0.76)-1.1380.255TCRBV51.29(2.28)1.10(0.91)-0.3840.707TCRBV60.97(3.50)0.92(1.99)-0.0440.965TCRBV70.88(4.59)0.99(1.27)-0.5030.615TCRBV91.28(4.18)1.13(1.07)-0.6210.535TCRBV111.78(1.07)1.00(0.43)-4.2430.000TCRBV121.07(6.89)1.02(2.55)-0.4580.647TCRBV130.81(0.77)1.02(0.40)-1.6710.095TCRBV140.71(0.99)0.95(0.58)-1.3450.179TCRBV151.83(2.19)1.08(1.13)-2.3360.019TCRBV160.92(3.09)0.96(1.60)-0.6510.515TCRBV172.13(3.39)1.05(0.71)-2.9570.003TCRBV181.79(1.92)0.96(0.72)-2.8240.005TCRBV191.44(1.62)1.01(0.61)-2.040.041TCRBV200.63(1.08)0.78(0.54)-1.5230.128TCRBV240.77(1.48)1.41(0.44)-1.0350.301

表4 差異表達(dá)的TCRBV基因在病例組與對照組中的秩和值比較(n =10)

3 討論

癲癇是一組由腦神經(jīng)元過度放電引起的，以反復(fù)發(fā)作、短暫腦功能失調(diào)為特征的臨床綜合征。當(dāng)前癲癇治療共識[8]認(rèn)為：癲癇確診后，如無針對病因治療的指征，除非發(fā)作稀疏，均需應(yīng)用AEDs控制發(fā)作。2/3以上新診斷的癲癇患者在經(jīng)過AEDs正規(guī)治療后發(fā)作可得到有效控制。約2/5的癲癇患者經(jīng)正規(guī)治療可以完全停藥。然而所有AEDs在使癲癇患者獲益的同時(shí)，均可能發(fā)生不良反應(yīng)，給患者帶來損害。cADRs是AEDs常見不良反應(yīng)之一，在接受AEDs治療的患者中，cADRs的發(fā)生率為3%左右。超過90%的AEDs誘發(fā)的cADRs發(fā)生于用藥后3個(gè)月內(nèi)，少數(shù)AEDs誘發(fā)cADRs發(fā)生在使用AEDs數(shù)年之后[2]。AEDs誘發(fā)cADRs常見的臨床表現(xiàn)為輕型的MPE，也可出現(xiàn)藥物超敏反應(yīng)綜合征(drug-induced hypersensitivity syndrome，DHS)、Stevens-Johnson綜合征(SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(toxicepidermal necrolysis，TEN)等嚴(yán)重類型而威脅生命[1，9-10]。

本研究收集LTG-cADRs患者與LTG耐受者的新鮮全血，提取PBMCs，以終濃度為25 μg/mL的LTG體外刺激并培養(yǎng)PBMCs，72 h后檢測IFN-γ、IL-5和TNF-β的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTG-cADRs患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的水平明顯高于LTG耐受者(P<0.05)，這提示LTG可在體外激活LTG-cADRs患者PBMCs分泌的IFN-γ，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與了LTG-cADRs的致病機(jī)制。該結(jié)果和Ko等[11]的研究結(jié)果一致，Ko等的研究顯示，用CBZ體外刺激培養(yǎng)CBZ誘發(fā)SJS(CBZ-SJS)組和CBZ耐受組的PBMCs后，CBZ-SJS組IFN-γ水平高于CBZ耐受組。另外，LTG-cADRs患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-5和TNF-β的水平均略高于LTG耐受者，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析出現(xiàn)細(xì)胞因子水平差異的原因如下：激活的T細(xì)胞分泌產(chǎn)生IFN-γ、IL-5和TNF-β，IFN-γ主要由CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)和增加多種細(xì)胞表達(dá)HLA分子，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。TNF-β主要由Th1細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)分泌產(chǎn)生，IL-5主要由介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生。LTG-cADRs患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的水平明顯高于LTG耐受者，提示LTG體外刺激并培養(yǎng)LTG-cADRs患者PBMCs，可能是以CD8+T細(xì)胞增殖為主，CD8+T細(xì)胞增殖分泌出了更多的IFN-γ。另外，在實(shí)驗(yàn)過程中，為促進(jìn)PBMCs的生長而加入了重組人IL-2，IL-2可能增強(qiáng)了IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄，使得IFN-γ水平更高。Rozieres等[12]在動物模型中觀察到CD8+T細(xì)胞在藥物超敏反應(yīng)中的致病作用。Wu等[13]以體外培養(yǎng)的方式觀察到CD8+T細(xì)胞在藥物超敏反應(yīng)中的致病作用，關(guān)于CBZ-cADRs的研究發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞不僅具有藥物特異性，而且在體外具有細(xì)胞毒性作用。

T細(xì)胞主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞免疫，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。TCR是所有T細(xì)胞表面關(guān)鍵的受體分子，其作用是識別抗原。健康人外周血中90%～95%的T細(xì)胞表達(dá)αβTCR，αβTCR由α和β兩條肽鏈組成。TCRβ鏈胞外區(qū)分為恒定區(qū)(C區(qū))及可變區(qū)(V區(qū))，TCRBV基因大部分位于人類7號染色體上，僅有小部分序列位于9號染色體上。對TCRβ鏈V區(qū)的氨基酸序列分析表明，TCR有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)即CDR1、CDR2和CDR3，其中以CDR3變異性最大，直接決定了TCR的抗原特異性。CDR3可直接在識別HLA-抗原肽復(fù)合體時(shí)與其抗原肽發(fā)生相互作用，TCRBV基因片段依據(jù)CDR3的V基因片段核苷酸的同源性被分成24個(gè)基因家族(TCRBV1～TCRBV24)，其中TCRBV5包含TCR BV5.1和TCR BV5.2兩個(gè)亞家族，TCRBV13包含有TCR BV13.1和TCR BV13.2兩個(gè)亞家族。TCRBV基因由V、D、J基因片段重排而成，由于TCRBV基因的多樣性使TCRβ鏈的CDR3區(qū)也呈現(xiàn)多樣性，這種多樣性以約107種抗原受體結(jié)構(gòu)不同的T細(xì)胞存在于人體內(nèi)，即人體內(nèi)存在著至少107種能識別各種抗原的淋巴細(xì)胞克隆[14]。不同的抗原刺激機(jī)體，機(jī)體會從眾多淋巴細(xì)胞克隆中選擇出受體結(jié)構(gòu)與之互補(bǔ)的淋巴細(xì)胞克隆。對于健康人，其TCRBV基因家族譜型呈現(xiàn)正態(tài)分布，而機(jī)體在疾病狀態(tài)下，或遭受某種抗原刺激時(shí)，淋巴細(xì)胞受體庫發(fā)生偏移，引起T細(xì)胞克隆增生。在不同的抗原刺激下，出現(xiàn)不同的T細(xì)胞克隆增生，引起只有少數(shù)V-(D)-J基因片段入選擴(kuò)增克隆的現(xiàn)象(即抗原對TCRBV基因片段的限制性取用)，TCRBV基因各家族差異表達(dá)，其呈現(xiàn)非正態(tài)分布[15]。Sieben等[6]在二苯胺引起的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，3組(共6組)HLA限制性克隆細(xì)胞表達(dá)TCRBV16。Pichler等[4]在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對青霉素過敏的患者，體內(nèi)存在藥物特異性T細(xì)胞克隆，TCR庫會出現(xiàn)偏移，TCRBV基因譜型呈寡克隆或多克隆。一項(xiàng)巴氨西林引起變態(tài)反應(yīng)的體外研究發(fā)現(xiàn)，克隆性增殖明顯的T淋巴細(xì)胞表達(dá)BV14、TCRBV2、BV3和BV5.1[5]。

以上研究表明，藥物可以在體外激活T細(xì)胞，引起淋巴細(xì)胞受體庫的偏移，出現(xiàn)TCRBV基因片段的限制性取用，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的T細(xì)胞克隆增生，導(dǎo)致TCRBV基因表達(dá)的差異。并且既往研究表明，PBMCs是免疫活性細(xì)胞的集合體，其主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等，參與固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生的過程，擔(dān)負(fù)重要的免疫功能，而用密度梯度法提取出的PBMCs，淋巴細(xì)胞可達(dá)90%以上，活細(xì)胞百分率在95%以上，可滿足檢測TCRBV基因的需要[16]。另外，PCR技術(shù)能夠檢測TCRBV基因各家族表達(dá)情況，RT-qPCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)檢測整個(gè)PCR進(jìn)程。RT-qPCR進(jìn)行定量分析時(shí)有兩種方法，即絕對定量法和相對定量法。相對定量法無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可利用熔解曲線排除非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增的干擾，更容易操作。本研究中對TCRBV基因表達(dá)在LTG-cADRs患者和LTG耐受者中的差異進(jìn)行檢測，因此相對定量法即可滿足實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析?；谝陨嫌^點(diǎn)，本研究對10例LTG-cADRs患者和10例LTG耐受者的PBMCs，運(yùn)用RT-qPCR的SYBR GreenⅠ熒光染料法，進(jìn)行了18個(gè)TCRBV基因(TCRBV2～TCRBV7、TCRBV9、TCRBV11～TCRBV20和TCRBV24)表達(dá)差異的檢測，以明確LTG-cADRs與TCRBV基因表達(dá)是否存在相關(guān)性。結(jié)果顯示，兩組中存在差異表達(dá)的TCRBV基因共有5個(gè)，分別是TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19。這5個(gè)差異表達(dá)的基因在兩組中的秩和值(其在LTG-cADRs患者中的表達(dá)量)較LTG耐受者高。上述結(jié)果提示LTG-cADRs可能與TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19基因的表達(dá)相關(guān)。然而，本次研究結(jié)果與既往的研究結(jié)果存在差異。如Naisbitt等[17]報(bào)道，在LTG-cADRs患者的PBMCs中，檢測到以CD4+T細(xì)胞為主的克隆增殖，這些T細(xì)胞表面均表達(dá)αβ-TCR，TCR BV5.1和TCR BV9基因呈優(yōu)勢表達(dá)，故認(rèn)為在LTG-cADRs發(fā)生的過程中，TCR BV5.1起關(guān)鍵作用。Hashizume等[18]在PB-cADRs患者外周血中發(fā)現(xiàn)一組顯著克隆增生的T細(xì)胞亞群，這些T細(xì)胞主要表達(dá)TCR BV5.1和TCR BV13.1，以Th2反應(yīng)為主，分泌導(dǎo)致表皮細(xì)胞甚至真皮細(xì)胞損害的細(xì)胞因子、顆粒酶、穿孔素及顆粒溶素，發(fā)生cADRs，該作者推測特異性TCR的表達(dá)與PB-cADR臨床表現(xiàn)的差異相關(guān)。存在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的可能原因如下：(1)cADRs類型和病情嚴(yán)重程度的差異對研究結(jié)果造成的影響。如在Naisbitt等的研究中，所納入的4例LTG-cADRs，其cADRs類型包括MPE、SJS、TEN和多形性紅斑合并淋巴結(jié)腫大各1例，而本研究中所納入LTG-cADRs的皮疹類型均為MPE。(2)本研究納入研究的病例數(shù)較少，僅收集到10例LTG-cADRs患者的血標(biāo)本，尚需更多樣本量進(jìn)行研究。(3)誘發(fā)cADRs的藥物不同。如Hashizume等的研究對象是以PB誘發(fā)cADRs的患者。這提示LTG、PB雖均屬于AAEDs，具有相似的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，但仍可能出現(xiàn)TCRBV基因的表達(dá)差異。

綜上可見，LTG可在體外激活LTG-cADRs患者的PBMCs分泌IFN-γ，這提示T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與了LTG-cADRs的致病機(jī)制。LTG-cADRs可能與TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19基因的表達(dá)相關(guān)。但本研究納入研究的LTG-cADRs患者較少，后續(xù)可擴(kuò)大樣本量深入研究，對LTG-cADRs患者與LTG耐受者的TCRBV基因表達(dá)差異進(jìn)行分析。

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