響應(yīng)面法優(yōu)化石上柏穗花杉雙黃酮提取工藝

王 剛,田應(yīng)彪,蔣永梅,何 群,袁仕夢(mèng),魏 瑋

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴州遵義 563000)

石上柏(SelaginelladoederleiniiHieron.)屬于蕨類卷柏科卷柏屬植物,多年生草本,也叫深綠卷柏,多分布在我國貴州、四川、重慶、廣西等地。該植物具有食用、藥用、保健價(jià)值,具有抗氧化[1-2]、抗炎[3]、抗腫瘤、抗誘變和抗突變的作用[4-8]。該植物含有雙黃酮、生物堿、木質(zhì)素、有機(jī)酸等化合物,其中雙黃酮是該植物主要的有效成分[9]。

穗花杉雙黃酮(amentoflavone)是石上柏中的雙黃酮化合物之一,是控制石上柏質(zhì)量的指標(biāo)成分(結(jié)構(gòu)式如圖1所示),在藥材中含量約為0.3%～0.7%[10]。如前面所述,穗花杉雙黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化、降血脂、抗菌及抗腫瘤等作用[11-14]。目前未見石上柏穗花杉雙黃酮提取工藝的研究報(bào)道,本文為了節(jié)約溶劑,同時(shí)改善提取效率,重點(diǎn)考察微波輔助提取穗花杉雙黃酮的效果,并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)。

圖1 穗花杉雙黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of amentoflavone

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石上柏 采自貴州赤水,編號(hào):SD20130916,存放于遵義醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室;穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品 生產(chǎn)批號(hào):160622,成都瑞芬恩生物有限公司;甲醇、乙腈 均為色譜純,成都科龍?jiān)噭┕尽?/p>

1100高效液相色譜儀、1100二極管陣列檢測(cè)器 美國安捷倫公司;C18Symmetry?色譜柱 美國Waters公司;SECURA124-1CN電子分析天平 德國賽多利斯公司;KQ118超聲波清洗器 北京佳源興業(yè)科技有限公司;DZ-2A型電熱真空干燥箱 北京北空興源濤科貿(mào)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 西安太康生物科技有限公司;Xinyi-1A微波提取儀 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司;FW80型高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 穗花杉雙黃酮溶液的提取 取干燥好的石上柏藥材10 g粉碎,過40目篩,置250 mL圓底燒瓶中,加入一定體積的95%乙醇,設(shè)置一定微波功率,在一定的時(shí)間和溫度下進(jìn)行微波提取,提取完成后過濾,將濾液減壓濃縮,轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,用乙醇定容作為穗花杉雙黃酮溶液。通過液相分析,測(cè)定穗花杉雙黃酮的峰面積,利用線性回歸方程計(jì)算穗花杉雙黃酮的含量,從而得到石上柏中穗花杉雙黃酮的得率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 固液比對(duì)得率的影響 固定溫度為50 ℃,提取功率為400 W,時(shí)間40 min,研究固液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30 g/mL對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對(duì)得率的影響 固液比1∶20 g/mL,提取功率為400 W,時(shí)間40 min,研究提取溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)穗花衫雙黃酮得率的影響。

1.2.2.3 微波功率的影響 固液比1∶20 g/mL,提取功率為400 W,提取時(shí)間40 min,提取溫度50 ℃,研究微波功率100、300、500、700、900 W對(duì)石上柏穗花衫雙黃酮得率的影響。

1.2.2.4 提取時(shí)間的影響 固液比1∶20 g/mL,提取功率為400 W,提取溫度50 ℃,研究提取時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min對(duì)石上柏穗花衫雙黃酮得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取溫度、微波功率、提取時(shí)間為自變量,以石上柏提取物中穗花杉雙黃酮得率為響應(yīng)值Y,根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品19.5 mg,加甲醇適量同置25 mL容量瓶中,200 W超聲溶解,室溫靜置,并用甲醇定容,搖勻,配制成0.78 mg/mL的穗花杉雙黃酮的溶液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密吸取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、2、3、4、5、6 mL,分別置于 10 mL 容量瓶中,加甲醇定容,搖勻,得系列對(duì)照品溶液,分別注入高效液相色譜儀中測(cè)定峰面積。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到穗花杉雙黃酮回歸方程為:Y=5293X-2881.8,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。結(jié)果表明穗花杉雙黃酮的濃度在78.0～468.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

1.2.6 HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)中對(duì)穗花杉雙黃酮溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描,綜合最大吸收情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm時(shí)的色譜峰靈敏度高,峰面積較好,所以確定330 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.7 HPLC流動(dòng)相的選擇 色譜柱:DikmaDiamons C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1%甲酸水,采用梯度洗脫程序(表2);檢測(cè)波長(zhǎng):330 nm;柱溫:25 ℃;流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;進(jìn)樣前樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾。在上述條件下,穗花杉雙黃酮與其它色譜峰達(dá)到了基線分離。

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 HPLC gradient elution program

1.2.8 微波提取法與其他提取方法的比較 本文將微波輔助提取法與傳統(tǒng)的2種提取方法相比較,以穗花杉雙黃酮的得率為考察指標(biāo),比較三種提取方法之間的差異。

1.2.8.1 乙醇回流提取法 取10.0 g石上柏于燒瓶中,加120 mL 95%乙醇(固液比1∶12 g/mL),置于80 ℃恒溫水浴鍋,提取2 h,過濾,取濾液于1000 mL容量瓶中,加95%乙醇定容至刻度。平行實(shí)驗(yàn)3次[15]。

1.2.8.2 索氏提取法 取10.0 g石上柏用濾紙包裹放入索式提取器內(nèi),并加入200 mL 95%乙醇,加熱回流,虹吸 2 h。將提取液倒入1000 mL容量瓶中,加95% 乙醇定容至刻度。平行實(shí)驗(yàn)3次[15]。

1.2.9 穗花杉雙黃酮得率的計(jì)算 穗花杉雙黃酮得率(%)=(c×100 mL)/m×100,式中,m為石上柏藥材總質(zhì)量(g);c為石上柏中穗花杉雙黃酮的濃度(g/mL)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 固液比對(duì)得率的影響 由圖2可知，隨著固液比例的增大,產(chǎn)品得率隨之增加,當(dāng)固液比在1∶15～1∶25 g/mL時(shí),得率基本沒有明顯變化。這可能是由于藥材中雙黃酮的量是一定的,繼續(xù)增加溶劑,很難得到更多的目標(biāo)產(chǎn)物,但得率較高?？紤]到固液比的增加會(huì)造成后處理的困難以及溶劑的浪費(fèi)。因此,固液比選擇1∶15 g/mL。

圖2 固液比對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of amentoflavone

2.1.2 提取溫度對(duì)得率的影響 由圖3可知，隨著溫度的增加,產(chǎn)品得率隨之增加,當(dāng)溫度高于50 ℃后,產(chǎn)品得率隨之下降,這可能是由于溫度增高、氧化加快等原因,使得具有一定熱不穩(wěn)定性的黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,轉(zhuǎn)變成非黃酮類成分,因而產(chǎn)品得率會(huì)減少。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在40～60 ℃的范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 提取溫度對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.3 Effect of temperature on yield of amentoflavone

2.1.3 微波功率的影響 由圖4可知，隨著微波功率上升,產(chǎn)品的得率隨之增加,當(dāng)微波功率超過500 W,產(chǎn)品的得率開始減少,經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn),可能是當(dāng)微波功率過高時(shí),溫度不易控制,同時(shí)反應(yīng)體系溫度開始上升,使受熱不穩(wěn)定的黃酮類成分氧化轉(zhuǎn)變成非黃酮類成分,因而產(chǎn)率下降。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在300～700 W的范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。

圖4 微波功率對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.4 Effect of microwave power on yield of amentoflavone

2.1.4 提取時(shí)間的影響 由圖5可知，當(dāng)提取時(shí)間小于40 min時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,得率增加。當(dāng)超過40 min時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,得率則反而呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì),這可能是由于穗花杉雙黃酮含有多個(gè)酚羥基,時(shí)間過長(zhǎng),在高溫下容易被氧化。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在30～50 min的范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 提取時(shí)間對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.5 Effect of extraction time on yield of amentoflavone

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化 通過Design-Expert軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析(結(jié)果見表3和表4),得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型:Y(%)=-1.48169+0.052A+5.125×10-4B+0.0264C+2.5×10-6AB-1.92554×10-18AC+6.25×10-6BC-5.675×10-4A2-9.8125×10-7B2-3.925×10-4C2。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 The results of experiment design

表4 響應(yīng)面法分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of the response surface quadratic mode

由表4可知,F=79.81,p<0.0001,表明模型極顯著;失擬項(xiàng)F=3.61,p>0.05,不顯著,證明回歸方程無失擬因素存在,同時(shí),模型R2=0.9903,表明該模型的擬合能夠較好地反映實(shí)際情況。一次項(xiàng)A、B、C,交互項(xiàng)BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2都有顯著影響,其中一次項(xiàng)各因素對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響依次為A>B>C,并且三個(gè)二次項(xiàng)A2、B2、C2都為p<0.0001,有極顯著影響,說明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,而是存在一定交互作用。模型的變異系數(shù)(C.V.)僅為3.04%,在可接受的范圍內(nèi)。另外,調(diào)整擬合優(yōu)度R2=0.9779,“預(yù)測(cè)擬合度”為0.8831,兩者的差值在0.20的可接受范圍內(nèi)?！靶旁氡取睘?4.488,表明模型精確;方差分析(ANOVA)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果表明,該模型完全可用于響應(yīng)值的預(yù)測(cè)。

2.2.2 各因素的交互影響分析 根據(jù)回歸方程得出不同因素之間相互影響結(jié)果見圖6～圖8,從該組圖可以分析出多個(gè)自變量對(duì)響應(yīng)值的影響。據(jù)圖6所示為溫度與微波功率的交互影響效應(yīng),由三維曲線和等高線圖可以看出,微波功率較低時(shí),得率隨功率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);提取溫度較高時(shí),得率隨微波功率呈下降趨勢(shì),溫度越高,下降幅度越大。雖然提取溫度和微波功率對(duì)響應(yīng)值而言都具有顯著影響,但二者交互對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著(p>0.05)。

圖6 Y=f(A,B)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖 Fig.6 Response surface plots of variable parameters A and B on the yield of amentoflavone

圖7 Y=f(A,C)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖 Fig.7 Response surface plots of variable parameters A and C on the yield of amentoflavone

圖8 Y=f(B,C)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖 Fig.8 Response surface plots of variable parameters B and C on the yield of amentoflavone

圖7顯示了微波功率為零水平,提取時(shí)間與提取溫度對(duì)穗花杉雙黃酮得率的影響和兩者之間的交互作用。提取溫度較低時(shí),得率隨提取時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);提取溫度較高時(shí),得率隨提取時(shí)間呈下降趨勢(shì),時(shí)間越長(zhǎng),下降幅度越大。雖然提取溫度和提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值而言都具有顯著影響,但二者交互對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著(p>0.05)。

圖8給出溫度為零水平時(shí),微波功率與時(shí)間之間的交互效應(yīng)的關(guān)系。在前50 min,得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,之后趨于減少。由于雙黃酮類化合物含有酚羥基,可能在長(zhǎng)時(shí)間受熱的情況下發(fā)生氧化等反應(yīng),而使產(chǎn)率減小。在300～500 W范圍內(nèi),得率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加,當(dāng)超過500 W后,得率逐漸減少。并且微波功率和提取時(shí)間的交互對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(p<0.05)。

2.2.3 驗(yàn)證結(jié)果 優(yōu)化得到的最佳提取條件為:微波功率為438.92 W,提取時(shí)間為37.13 min,提取溫度為46.78 ℃,穗花杉雙黃酮得率預(yù)測(cè)值為0.34%。實(shí)際調(diào)整微波功率400 W,提取時(shí)間為37 min,提取溫度為47 ℃,穗花杉雙黃酮得率為0.33%±0.08%,與預(yù)測(cè)值相比較無顯著性差異(p>0.05)。

2.3 穗花杉雙黃酮含量測(cè)定

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,按“1.2.7”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算峰面積的RSD為0.32%,表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液,在室溫下分別于0、2、4、8、12 h,按“1.2.7”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算峰面積的RSD為1.32%,供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同批石上柏藥材5份,每份樣品精密稱定8.0 g,按“1.2.4”方法制備及“1.2.7”色譜條件測(cè)定峰面積,并計(jì)算其含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,計(jì)算峰面積的RSD為1.35%,表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批石上柏樣品3.5 g(穗花杉雙黃酮濃度為2.345 mg/g藥材),精密稱定,精密加穗花杉雙黃酮溶液10.0 mL(濃度為0.78 mg/mL),待溶劑揮干后,依法制成樣品溶液,測(cè)定,計(jì)算回收率。計(jì)算穗花杉雙黃酮平均回收率為99.03%,RSD為2.03%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明方法回收率較好。

2.4 與傳統(tǒng)提取方法相比

本研究將微波輔助提取法與傳統(tǒng)2種提取方法以穗花杉雙黃酮的含量為考察指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比。如表5所示,微波輔助提取法與其它2種提取方法對(duì)比不僅增加了提取效率(穗花杉雙黃酮的含量提高了近2倍),還顯著地降低了提取時(shí)間(從120 min降低到37 min)。通過對(duì)3種提取方法進(jìn)行比較,證明了微波輔助提取法具有巨大的潛力,有望成為一種從石上柏中快速、高效、綠色的提取穗花杉雙黃酮的方法。這3種方法的重復(fù)性在97.71%～99.62%之間,RSD低于1.00%。

圖9 高效液相色譜圖Fig.9 HPLC spectra of amentoflavone and the extract from Selaginella doederleinii注：A:穗花杉雙黃酮對(duì)照品;B:石上柏乙醇提取物;1-穗花杉雙黃酮。

表5 不同提取方法提取效果的影響(n=3)Table 5 Effect of different extraction methods on the extraction yield of amentoflavone(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)穗花杉雙黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,通過Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),建立了石上柏中穗花杉雙黃酮提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式回歸模型。方差分析結(jié)果表明,該模型準(zhǔn)確可靠,可用于石上柏穗花杉雙黃酮得率的預(yù)測(cè)和分析。優(yōu)化得到的最佳工藝條件為:固液比為1∶15 g/mL,實(shí)際調(diào)整微波功率400 W,提取時(shí)間為37 min,提取溫度為47 ℃,穗花杉雙黃酮得率預(yù)測(cè)值為0.34%,實(shí)際得率為0.33%±0.08%,與預(yù)測(cè)值相比較無顯著性差異(p>0.05)。對(duì)3種提取方法進(jìn)行比較,表明了微波輔助提取適合石上柏穗花杉雙黃酮的提取,在穗花杉雙黃酮得率和提取時(shí)間均優(yōu)于索式提取和乙醇回流提取,對(duì)貴州赤水石上柏資源的研究開發(fā)提供了一定的參考價(jià)值。

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