NaCl處理對酸棗幼苗內源激素含量的影響

涂文文，魯曉燕，王曉麗，白茹

(石河子大學農(nóng)學院/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室， 新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】新疆土壤鹽堿化嚴重[1]，截止2015年，新疆總耕地面積4 124 563公頃，鹽堿地面積204 501公頃[2]，鹽堿地面積占總耕地面積4.96%。土壤鹽堿化不僅導致土壤生產(chǎn)力降低，而且引發(fā)諸多生態(tài)環(huán)境問題，是制約新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一 。大部分植物在土壤含鹽量為0.3% 時受到危害，大于 0.5% 時即不能生長[3]。棗樹是原產(chǎn)于我國的特有果樹，在我國栽培歷史悠久，分布廣泛[4]。棗樹結果早，壽命長，管理方便，收益快，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值[5]。新疆棗樹種植總面積495 548公頃[2]，在鹽堿地上栽培的棗樹存在缺苗、生長量減少、產(chǎn)量和品質下降等不同程度的鹽害癥狀，影響了新疆棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]。優(yōu)質棗樹主要靠嫁接繁殖，其耐鹽性主要取決于砧木，酸棗(ZiziphusjujubaMill)具有抗干旱、耐鹽堿的特性，常用作棗的優(yōu)良砧木[7]。植物的內源激素包括生長素(growth substance，IAA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、玉米素(zeatin，ZT)等，植物內源激素與鹽脅迫的生理響應關系密切，研究NaCl處理對酸棗幼苗內源激素的影響，對酸棗的耐鹽機理和新疆鹽堿地資源的利用有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】鹽脅迫下小麥幼苗[8]、楊樹嫩莖質外體[9]、ABA的含量增加，多數(shù)植物在鹽脅迫下表現(xiàn)出不同程度的 ABA 積累[10]。Munns和Sharp[11]認為，在鹽脅迫下ABA 作為最初調節(jié)過程的信號調節(jié)植物對鹽脅迫的適應性反應。短期鹽脅迫下植物生長主要受根部鹽滲透的影響 ，葉片生長受 ABA 的調節(jié)[12]，鹽脅迫促進了ABA 和乙烯的合成，抑制了 IAA、CK、ZR的合成，激素之間通過相互協(xié)調共同調控植物的生長發(fā)育及脅迫后的生理生化反應[13]，作為衡量信號的植物內源激素與植物耐鹽性的關系一直是植物抗鹽機理研究的主要內容。前期以酸棗為材料，研究了不同濃度NaCl脅迫對幼苗活性氧、細胞膜透性、根系活力、不同器官離子含量的影響[14]，以及NaCl脅迫對酸棗幼苗AsA-GSH循環(huán)的影響[15]?！颈狙芯壳腥朦c】目前對于酸棗幼苗內源激素與耐鹽性關系的研究少有涉及。研究NaCl處理對酸棗幼苗內源激素含量的影響?！緮M解決的關鍵問題】通過研究NaCl處理對酸棗幼苗內源激素含量的影響，為解析酸棗的耐鹽機理和新疆鹽堿地資源的利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗在石河子大學農(nóng)學院進行。供試材料選用酸棗種子，挑選大小一致，健康飽滿的酸棗種子，室溫下清水浸泡24 h以促進發(fā)芽。用0.5% KMnO4消毒30 min，置于人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)中培養(yǎng)，光照強度12 000 lx，光照時間14 h，黑暗時間10 h；相對濕度65%～70%；溫度25～28℃。發(fā)芽盒內加入蒸餾水以維持種子濕潤，待幼苗長出2片真葉后，選擇長勢均一的幼苗用2 cm厚的泡沫板懸浮于水培盒中。水培盒大小為19 cm×13 cm×11 cm(長×寬×高)。每個水培盒加1倍日本園試配方營養(yǎng)液500 mL，每3 d更換一次營養(yǎng)液。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

幼苗長到6片真葉時，挑選根系健壯且生長一致的幼苗進行處理。(1)對照：日本園試配方營養(yǎng)液；(2)日本園試配方營養(yǎng)液加50 mmol/L NaCl；(3)日本園試配方營養(yǎng)液加100 mmol/L NaCl；(4)日本園試配方營養(yǎng)液加150 mmol/L NaCl；(5)日本園試配方營養(yǎng)液加200 mmol/L NaCl。每個處理重復3次，每個重復15株幼苗。為避免鹽激反應，NaCl濃度以每天50 mmol/L的梯度逐步遞增，全部處理于同1 d達到目標濃度，設此時為NaCl處理第0 h。在處理第0、6、12、24、48、96和144 h進行取樣，取樣完畢后放入-80℃冰箱保存，用于激素含量的測定。

1.2.2 HPLC 流動相的選擇

高效液相色譜儀(LC-2010AHT，日本島津)，離心機(HITACHI，CR22GIE)，旋轉蒸發(fā)器(RE-2000A)。玉米素、赤霉素、生長素、ABA標準品購自Sigma公司，甲醇、乙酸為色譜級，乙酸乙酯、鹽酸、磷酸氫二鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)為分析純，試驗用水為超純水。所有試劑使用前均通過0.45 μm微孔濾膜過濾。

HPLC條件：AgilentC18ZORBAX反向色譜柱(150 mm×46 mm，5 μm)；柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL；采用切換波長法以外標法進行定量測定；流動相V(甲醇)∶V(超純水含1 %乙酸)=47∶53。

1.2.3 標準品的配置

分別稱取0.005 g ZT、0.01 g IAA、0.125 g GA3和0.005 g ABA標準品，用純甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶，即為4種激素混合標準溶液。以混合標準溶液為母液，逐級稀釋，配制成含有ZT、GA3、IAA和ABA的系列標準溶液，采用優(yōu)化的色譜條件，依次進樣檢測，以激素質量濃度(ng/mL)為橫坐標，以峰面積(mAU)為縱坐標，建立4種激素的回歸方程。

標準曲線的繪制：混合標準品用50 mL 100%甲醇溶解，吸取25 mL上述混合標準品溶液加入25 mL甲醇稀釋，依次吸取前一步標準品溶液加入25 mL甲醇稀釋，依次稀釋3次，形成5個濃度，測出每個濃度的峰面積，從而計算出各個激素含量，繪制標準曲線。

1.2.4 測定指標

準確稱取0.2 g冷藏的酸棗材料，加入10 mL預冷的80%甲醇和液氮研磨成勻漿，密封后置于4℃冰箱靜置不同時間，4℃條件下10 000 r/min離心10 min后取上清液，殘渣加入80%甲醇離心重復3次合并上清液，將全部的上清液于40℃條件下旋蒸至原體積的1/3(每次旋蒸樣品時要用注射器吸取旋蒸瓶內殘留的提取液減小誤差)將余下的提取液用Na2HPO4調pH=8，加入30 mL的石油醚脫色3次，棄醚相，再加入0.1的PVPP，震蕩30 min后過濾。將濾液用0.1的HCL調整pH=3，加20 mL乙酸乙酯渦旋后靜置5 min，待分層后，取上層酯相，重復萃取4次合并酯相。將合并的酯相在40℃條件下減壓蒸干，殘留物加2 mL的乙酸溶解3次后將溶解液過sep-pak18小柱純化，用甲醇洗脫后再40℃條件下減壓蒸干，用80%甲醇溶解定容至2 mL溶液(每次溶解樣品時要用注射器吸取旋蒸瓶內殘留的溶解混合液減小誤差)過0.45 μm的微孔濾膜后HPLC分析，計算出ABA、GA3、IAA、ZT的峰面積，從而計算出ABA、GA3、IAA、ZT的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8和Spass 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1不同濃度NaCl處理對酸棗幼苗葉，根ABA含量的影響

研究表明，與對照相比，50、100、150和200 mmol/L NaCl處理0 h，酸棗幼苗葉和根中ABA含量均無顯著變化； NaCl處理6 h，酸棗葉中ABA含量均顯著升高，分別是對照的1.61、2.24、2.74、3.51倍，根中的ABA的含量只有150和200 mmol/L高于對照，分別是對照的17.04、22.31倍。 NaCl處理12、24、48、96和144 h，50、100、150和200 mmol/L酸棗幼苗葉和根中ABA含量均顯著高于對照，增幅最大的分別是200 mmol/L NaCl處理的酸棗幼苗葉和根中ABA含量。并且在NaCl處理96和144 h，隨著NaCl濃度的增加，酸棗苗葉和根中ABA的含量均增加，不同濃度之間差異顯著。

與0 h相比，在50、100、150和200 mmol/L NaCl處理下，隨處理時間的延長酸棗葉片和根的ABA含量顯著上升。在50、100、150和200 mmol/L NaCl處理144 h酸棗葉片ABA含量分別是0 h的5.21、5.75、5.09、4.73倍，根中ABA含量分別是0 h的15.73、8.73、4.82、3.71倍。100、150和200 mmol/L NaCl處理下，隨著處理時間點的增大，酸棗幼苗根和葉中ABA的含量均增加，在144 h ABA的含量增加最顯著，不同時間點之間差異顯著。圖1

注：不同小寫字母表示同一時間不同濃度間的顯著水平(P<0.05， n=3)， 不同大寫字母表示同一濃度不同時間點的顯著水平(P<0.05， n=3)下同

Note:

圖1 酸棗葉、根在NaCl處理下ABA含量變化
Fig.1 Effect of NaCl treatment on ABA in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.2不同濃度NaCl處理對酸棗葉，根GA3含量的影響

研究表明，與對照相比，50、100、150和200 mmol/L NaCl處理6、12、24、48、96和144 h酸棗幼苗葉和根的GA3含量顯著下降，隨著濃度的升高下降幅度增加，并且同一時間點不同濃度之間差異顯著。酸棗幼苗在50、100、150、200 mmol/L NaCl處理0 h葉片中GA3含量降幅分別為5.32%、14.38%、22.10%、29.59%，根中GA3含量降幅分別為9.29%、31.91%、40.33%、62.77%；酸棗幼苗在50、100、150和200 mmol/L NaCl處理144 h葉中GA3含量的降幅分別為36.33%、49.41%、41.42%、58.60%，根中GA3含量降幅分別為15.38%、65.50%、32.15%、73.71%，同一處理時間與對照相比，200 mmol/L NaCl處理時下降最顯著。

與0 h相比，酸棗葉和根在50、100、200 mmol/L NaCl處理下隨時間的延長GA3含量整體顯著降低，處理144 h葉中GA3含量的降幅分別為24.35%、33.53%、33.84%，根中降幅分別為16.49%、54.64%、36.79%；酸棗幼苗葉在0 mmol/L NaCl處理下隨時間點的增大GA3含量整體顯著增加，酸棗幼苗根相同處理下GA3含量整體顯著降低；酸棗幼苗根在150 mmol/L NaCl處理144 h的GA3含量顯著升高。圖2

圖2 酸棗葉、根在NaCl處理下GA3含量變化

2.3不同濃度NaCl處理對酸棗幼苗葉，根ZT含量的影響

研究表明，與對照相比，100、150和200 mmol/L NaCl處理6 h酸棗幼苗葉中ZT含量顯著下降，降幅分別是24.23%、34.78%、52.40%；100、150和200 mmol/L NaCl處理6 h酸棗幼苗根中ZT含量顯著下降，降幅分別是18.56%、34.56%、42.14%。 100、150和200 mmol/L NaCl處理144 h酸棗幼苗葉中ZT含量的降幅分別為61.69%、72.01%、78.04%，酸棗幼苗根中ZT含量的降幅分別為38.16%、44.57%、67.46%；酸棗幼苗葉在50 mmol/L NaCl處理0、6、12、24和48 h ZT含量顯著高于對照，在96、144 h時顯著低于對照。酸棗幼苗葉和根在100、150和200 mmol/L NaCl處理6、12、24、48、96和144 h ZT含量顯著下降，同一處理時間與對照相比，200 mmol/L NaCl處理時下降最顯著。

與0 h相比，酸棗葉在100、150、200 mmol/L NaCl處理下隨時間的延長ZT含量整體顯著降低，144與0 h相比葉中ZT含量的降幅分別47.28%、46.31%、50.18%，在150、200 mmol/L NaCl處理時幼苗根ZT含量整體顯著下降，降幅分別為8.05%、38.00%。圖3

圖3 酸棗葉、根在NaCl處理下玉米素含量隨時間變化
Fig.3 Effect of NaCl treatment on ZT in leaves and of sour jujube seedlings

2.4不同濃度NaCl處理對酸棗幼苗葉，根IAA含量的影響

研究表明，與對照相比，在6、12、24、48、96和144 h，100、150、200 mmol/L NaCl處理時酸棗幼苗葉和根的IAA含量顯著降低，在6 h，50、100、150、200 mmol/L NaCl處理下酸棗幼苗葉IAA含量的降幅分別是 17.38%、29.88%、47.36%、59.63%，酸棗幼苗根中IAA含量的降幅分別是10.16%、17.56%、41.6%、51.63%，在144 h，50、100、150、200 mmol/L NaCl處理下酸棗幼苗葉IAA含量的降幅分別是21.13%、40.40%、44.67%、51.61%，酸棗幼苗根IAA含量的降幅分別是28.46%、46.61%、52.56%、58.77%，同一處理時間與對照相比，200 mmol/L NaCl處理時下降最顯著。

與0 h相比，酸棗幼苗葉在50、100、150 mmol/L NaCl處理144 h的IAA含量差異顯著，降幅分別是20.60%、31.97%、6.32%，酸棗幼苗根在100、150、200 mmol/L NaCl處理144 h的IAA含量差異顯著，降幅分別是15.07%、7.40%、8.5%。圖4

圖4 酸棗葉、根在NaCl處理下生長素含量隨時間變化
Fig.4 Effect of NaCl treatment on IAA in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.5不同濃度NaCl處理對酸棗幼苗葉，根IAA/ABA比值的影響

研究表明，與對照相比，同一時間酸棗葉，根在0、50、100、150、200 mmol/L NaCl處理下IAA/ABA的值均顯著下降。

與0 h相比，同一濃度，酸棗葉在0、50、100、150、200 mmol/L NaCl處理在0到48 h的IAA/ABA值隨時間變化呈顯著降低趨勢，酸棗葉在50、100、150、200 mmol/L NaCl處理在48到144 h時IAA/ABA的值隨時間變化無顯著變化；酸棗根在50、100、150、200 mmol/L NaCl處理在0到24 h時IAA/ABA的值隨時間變化而呈顯著降低趨勢，酸棗根在50、100、150、200 mmol/L NaCl處理在24到144 h時IAA/ABA的值隨時間變化無顯著變化。圖5

圖5 酸棗葉、根IAA/ABA的值隨時間變化
Fig.5 Effect of NaCl treatment on IAA/ABA in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.6不同濃度NaCl處理對酸棗幼苗葉、根GA3/ABA比值的影響

研究表明，與對照相比，50、100、150、200 mmol/L NaCl處理相同時間，酸棗葉、根GA3/ABA的值均顯著下降。

與0 h相比，酸棗葉在0 mmol/L NaCl處理，GA3/ABA值隨處理時間的延長無顯著變化，100、150、200 mmol/L NaCl處理在0到96 h時隨著時間的增加GA3/ABA 的比值顯著降低，50 mmol/L NaCl處理在0到24 h時隨著時間的增加GA3/ABA 的比值顯著降低。酸棗根在0、100、150，200 mmol/L NaCl處理下在0到24 h時隨著時間的延長GA3/ABA 的比值顯著降低。圖6

圖6 酸棗葉、根GA3/ABA的值隨時間變化

3 討 論

ABA在植物響應鹽脅迫時有至關重要的作用。鹽脅迫下，植物通過激活ABA的合成途徑和抑制其降解途徑使得植物體內ABA含量增加[16]，在NaCl脅迫下，高濃度鹽脅迫后楊樹內源激素ABA含量在短時間內迅速升高[17]；長葉紅砂幼苗在NaCl濃度≥ 100 mmol/L時ABA含量隨NaCl濃度的升高而逐漸升高[18]。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗葉和根在同一濃度NaCl處理隨時間的增加ABA含量顯著增加；在同一處理時間100、150、200 mmol/L NaCl處理均顯著升高，這可能是因為隨著鹽處理濃度的增大，ABA含量的上升促使氧自由基產(chǎn)生與清除之間能夠維持動態(tài)平衡，從而降低了鹽脅迫對細胞膜系統(tǒng)的氧化傷害同時在逆境下ABA含量升高可激活一系列抗性基因及蛋白的表達[19]，ABA 參與質膜 ATP 酶和液泡膜 ATP 酶的相關修飾過程，提高質子泵活性，為 Na+/ H+反向運輸體提供了更多的驅動力，有效降低酸棗胞內 Na+的含量，同時增強 K+的選擇性吸收，有益于維護細胞膜的穩(wěn)定性，提高植物對鹽分離子的耐受性是植物逆境自我保護的一種表現(xiàn)[20]。

GA3在緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)及植物生長方面也發(fā)揮了重要作用。溫福平等[21]發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，GA3能提高粳稻日本晴(Oryza sativaL． cv． Nipponbare) 種子的發(fā)芽勢，并可以顯著的恢復鹽脅迫下種苗根和芽的伸長生長，緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用。在300 mmol/L NaCl脅迫下，吳屯楊和荷蘭楊在處理第15 d GA含量顯著低于對照[22]，王鵬等[23]研究發(fā)現(xiàn)油葵 GA3的含量隨著 NaCl濃度的增加表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。於麗華等[24]研究發(fā)現(xiàn)，從不同 NaCl 濃度對甜菜葉片中GA3含量影響來看，GA3含量隨著NaCl濃度的升高而降低。研究結果顯示，酸棗在同一時間與對照相比50、100、150、200 mmol/L NaCl幼苗葉和根的赤霉素含量均顯著下降并且隨著NaCl處理濃度的增加下降越顯著，這可能是由于在低濃度鹽環(huán)境中酸棗幼苗隨著鹽濃度的升高增加了膜脂過氧化產(chǎn)物MDA，導致膜功能紊亂使得 GA3含量降低[25]。

在NaCl脅迫下草莓根系和葉ABA含量增加，IAA、GA和ZT含量減少[26]，Kuiper等[27]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫使得耐鹽大麥品種根中ZT、ZR含量迅速下降，陽燕娟[28]的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下西瓜幼苗ZT含量明顯減少。研究結果顯示，在同一時間100、150、200 mmol/L NaCl處理幼苗葉中ZT含量均低于對照并且有顯著差異，同一時間50 mmol/L NaCl處理幼苗葉中ZT含量顯著高于對照，在144 h時顯著低于對照，對照和50 mmol/L NaCl處理有上升趨勢這可能是因為酸棗幼苗初期需要大量ZT來促進酸棗幼苗細胞分裂，而100、150、200 mmol/L NaCl幼苗葉和根隨時間的增加都有降低的趨勢，這可能是由于鹽脅迫是通過降低SOD的活性，削弱清除自由基的能力，促進膜脂過氧化作用，導致膜脂過氧化產(chǎn)物(如MDA)積累。然后這些過氧化產(chǎn)物與一些細胞組分進行反應，使一些酶和膜(結構和功能)遭到破壞，導致質膜透性增大，胞內溶質外滲，外界鹽離子進入，從而破壞胞內離子平衡，導致代謝紊亂，使得酸棗幼苗葉和根ZT含量降低[29]。

IAA 影響植物多種生理過程，但IAA與鹽脅迫關系研究相對較少。Wang等[30]認為鹽脅迫下IAA的運輸通路在側根系統(tǒng)的形成中發(fā)揮了重要作用，證明了IAA的轉運活性決定了側根的產(chǎn)生和伸長，形成適應鹽脅迫的根系系統(tǒng)，增強植物對鹽漬環(huán)境的耐受能力。對照和50 mmol/L NaCl堿茅幼苗葉中IAA含量也都呈上升趨勢，但是200、400 mmol/L NaCl堿茅幼苗葉中IAA含量初期上升，后期下降[31]。鹽處理的堿茅幼苗葉中IAA含量在處理初期雖然呈上升趨勢，但都低于CK，并且隨著鹽脅迫濃度和時間的增加呈下降趨勢[32]。研究發(fā)現(xiàn)同一時間與對照相比，NaCl處理幼苗葉和根中IAA含量均顯著降低，同一濃度，與0 h相比50和100 mmol/L NaCl葉中IAA含量顯著降低，這可能酸棗幼苗在NaCl處理下因為離子毒害打破了離子平衡，高濃度Na+通過 Na+/H+逆向轉運蛋白介導根部細胞 Na+的外排和H+內向運輸[33]，破壞了正常的胞外pH、環(huán)境，從而使 IAA 的運輸受到很大的抑制。同一濃度，與0 h相比，50和100 mmol/L NaCl根中IAA含量初期先上升，后期下降，可能是由于當酸棗幼苗遭遇鹽脅迫時，通過誘導非色氨酸途徑中關鍵酶腈水解酶 NIT1 與 NIT2(nitrilase1/2)促進 IAA合成量的增加，使 IAA 的合成水平增加以供自身生長[34]，因此，處理初期IAA含量呈上升趨勢，但是由于鹽脅迫的影響，導致調節(jié)IAA氧化酶活性增加，加快了IAA的降解使得IAA含量降低[35]。

王琦等[36]研究發(fā)現(xiàn) CO2濃度升高使植物中 IAA 含量升高，而降低 ABA含量故 IAA/ABA的比值會升高，而GA3的變化與IAA 總體一致，所以也提高了GA3/ABA 的比值，由于IAA 能夠促進細胞伸長、分裂，而ABA會降低植物生長勢，產(chǎn)生休眠。此比值降低能夠增強抑制生長發(fā)育的作用，從而抑制植物生長。GA3的變化與 IAA 總體一致，由于GA3能夠促進酸棗幼苗生長，因此，GA3/ABA 降低也能使植物進入休眠，不利于酸棗生長。研究發(fā)現(xiàn)隨著NaCl處理濃度和時間的增加酸棗幼苗葉子有萎蔫的現(xiàn)象，同一時間，與對照相比，酸棗幼苗葉和根在50、100、150、200 mmol/L NaCl處理時的IAA/ABB、GA3/ABA的比值隨時間變化顯著降低，同一濃度，與0 h相比，酸棗幼苗葉和根在50、100、150、200 mmol/L NaCl處理144 h的IAA/ABB、GA3/ABA的比值顯著降低，可見ABA與IAA、GA3存在著拮抗作用，由于鹽濃度的增加導致ABA含量顯著增加，而IAA、GA3含量也顯著下降。

4 結 論

與對照相比，同一時間點下對應的各鹽濃度處理24到144 h后，酸棗幼苗葉片和根的ABA含量均顯著增加，并且同一時間點下鹽處理濃度越大ABA含量增加越顯著，同一時間點下對應的鹽濃度處理6到144 h后，酸棗幼苗葉片和根的IAA/ABA、GA3/ABA比值、IAA、GA3含量，酸棗幼苗根的ZT含量均顯著降低。

與0 h相比，在同一鹽濃度處理下隨著時間的推移，酸棗幼苗葉片和根的ABA含量顯著增加，但增加的速度隨著時間的推移趨于平緩，IAA/ABA、GA3/ABA的比值前期顯著降低，中后期下降速度趨于平緩。

NaCl處理下， 酸棗幼苗通過增加葉和根ABA含量，降低IAA、ZT、GA3含量、IAA/ABA和GA3/ABA的比值來適應鹽處理帶來的影響。