不同加工方式亳白芍的高效液相指紋圖譜及多成分含量比較

梁德勤，趙園園，羅 云，金傳山，吳德玲，張 偉，王 林，凌 偉

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 2.安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，安徽 亳州 236800)

白芍為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPalL.)的根，主產(chǎn)于安徽、四川、浙江及山東菏澤，其中以安徽省亳州市產(chǎn)量最大，市場占有率最高。產(chǎn)于亳州的白芍又習(xí)稱“亳白芍”。據(jù)了解，現(xiàn)亳白芍的種植面積達(dá)133 km2，并有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢。目前，亳白芍飲片的加工與炮制主要遵循2015年版《中華人民共和國藥典》以及2005年版《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》有關(guān)要求進(jìn)行，即將鮮白芍置沸水中煮后除去外皮，曬干為白芍藥材；再將白芍藥材通過軟化、切片和干燥等環(huán)節(jié)形成白芍飲片[1-2]。由于白芍藥材較難干燥，如遇陰雨天氣，未完全干燥的藥材易發(fā)黏，藥農(nóng)不得已使用硫熏的方法來防止白芍發(fā)黏變色，從而導(dǎo)致白芍中芍藥苷含量下降，二氧化硫殘留量超標(biāo)，影響白芍質(zhì)量[3]。此外，將白芍藥材切制為飲片需要長時(shí)間浸泡、潤制等軟化環(huán)節(jié)導(dǎo)致有效成分流失嚴(yán)重[4]。近年來，有企業(yè)采用產(chǎn)地加工與炮制一體化的加工方式，在產(chǎn)地將白芍鮮藥直接加工為白芍片，縮短了加工時(shí)間，且減少了有效成分芍藥苷的流失。對于亳白芍產(chǎn)地加工與炮制一體化加工技術(shù)參數(shù)已有較多報(bào)道，而采用產(chǎn)地加工與炮制一體化的加工方式形成趁鮮片與傳統(tǒng)片標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜和多指標(biāo)成分的分析未見報(bào)道。

本研究主要以亳白芍不同加工方式飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液為研究對象，以高效液相色譜法建立不同加工方式亳白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜，并以指紋圖譜共有峰相對峰面積對所有樣品進(jìn)行聚類分析；同時(shí)對亳白芍不同加工品標(biāo)準(zhǔn)煎液中沒食子酸等7種成分含量進(jìn)行測定，以更加全面地評價(jià)亳白芍傳統(tǒng)切制、煮后趁鮮切制以及鮮品直接切制3種不同加工方式對其飲片質(zhì)量的影響，為亳白芍產(chǎn)地加工與炮制一體化應(yīng)用的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司；島津ATY224-電子天平：日本Shimadzu；賽多利斯Sartorius百萬分之一電子天平：德國Sartorius公司；津騰GM-0.5A隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；科恒DL-1電子萬用電爐：上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

沒食子酸對照品(批號YAO505YA14，純度≥98%)、氧化芍藥苷對照品(批號Y31D5J1，純度≥98%)、芍藥內(nèi)酯苷對照品(批號Z16M6B1，純度≥91.4%)、芍藥苷對照品(批號X27F8C30162，純度≥98%)、苯甲酸對照品(批號TS0911CA14，純度≥98%)、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖對照品(批號P29F7F10218，純度≥99%)、苯甲酰芍藥苷對照品(批號P02D7F26004，純度≥98%)：均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

白芍采自安徽省亳州市周邊鄉(xiāng)鎮(zhèn)，采集信息見表1，所有采集的白芍新鮮根部均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院金傳山教授鑒定為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPalL.)的根。

表1 亳白芍樣品采集信息表

注：①BS1-BS9采自安徽省亳州市譙城區(qū)；②BS10雖采自毗鄰亳州市的河南省，但為亳白芍種質(zhì)

10批白芍鮮品均在安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司按照前期研究確定的工藝分別進(jìn)行飲片加工。

白芍傳統(tǒng)片A1—A10：鮮白芍煮后，滾筒去皮機(jī)去皮，低溫烘干，即得白芍藥材；再將白芍藥材浸泡、潤制等軟化至適宜程度，置切藥機(jī)上切2～3 mm圓片，低溫烘干，得樣品A1-A10。

白芍趁鮮片B1-B10：鮮白芍煮后，滾筒去皮機(jī)去皮，低溫烘干至適宜程度，置切藥機(jī)上切2～3 mm圓片，低溫烘干，得樣品B1-B10。

白芍生斜片C1-C10：鮮白芍滾筒去皮機(jī)去皮，置切藥機(jī)上切2～3 mm斜片，低溫烘干。得樣品C1-C10。白芍生斜片近年大量出口至韓國及中國臺灣，在中國大陸鮮少應(yīng)用，因此本研究擬對其質(zhì)量進(jìn)行研究。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖和苯甲酰芍藥苷適量于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，即得混合對照品溶液，用于指認(rèn)指紋圖譜共有峰。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液的制備 精密稱取白芍飲片20 g于圓底燒瓶中，加入7倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min，過濾，收集濾液，濾渣再用6倍量水煎煮40 min，合并兩次濾液，濃縮后轉(zhuǎn)移，并以水定容至100 mL容量瓶作為儲備液備用。精密移取儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻后靜置20 min，分出上清液，以0.45 μm有機(jī)濾頭濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件 美國Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)。二元梯度洗脫程序：0～20 min，5%→20% B；20～30 min，20%→25% B；30～45 min，25%→30% B；45～55 min，30%→35% B。柱溫為25 ℃，容積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。檢測波長：0～8 min，274 nm；8～14 min，214 nm；14～18 min，257 nm；18～20.5 min，232 nm；20.5～28 min，220 nm；28～34 min，228 nm；34～38 min，217 nm；38～55 min，229 nm。各成分最大吸收波長分別以全波長掃描確定，芍藥苷在最大吸收波長處色譜峰過高，影響其余小峰的觀察，因此未采用最大吸收波長。檢測時(shí)間為55 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 依照各點(diǎn)均勻分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的原則，計(jì)算好最低濃度與最高濃度后，等間距配制或稀釋中間3個(gè)濃度，將各對照品配制后，分別進(jìn)樣10 μL，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取樣品A6，按“2.1.2”項(xiàng)下供試液制備方法制備供試液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以芍藥苷為參照峰，測得各色譜峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.07%，各色譜峰相對峰面積RSD均小于0.3%，證明白芍指紋圖譜及多成分分析方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品A6，按“2.1.2”項(xiàng)下供試液制備方法平行制備6組供試液，分別進(jìn)樣，以芍藥苷為參照峰，測得各色譜峰相對保留時(shí)間RSD均小于0.3%，各色譜峰相對峰面積RSD均小于1.0%，證明白芍指紋圖譜及多成分測定方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品A6，按“2.1.2”項(xiàng)下供試液制備方法制備供試液，在室溫放置0、2、4、8、12、24、48 h后分別進(jìn)樣，以芍藥苷為參照峰，測得27個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于0.1%，各色譜峰相對峰面積RSD均小于0.1%，表明供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表2 7種成分線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取同一已知含量白芍樣品6份，每份5 g，精密稱定，分別精密加入7種對照品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下供試液制備方法制備供試液(等比例縮小一倍)，并進(jìn)樣測定，結(jié)果7個(gè)化合物的平均加樣回收率分別為99.00%、101.80%、100.77%、98.86%、99.58%、98.76%、98.47%，RSD均小于3%，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)煎液定量方法準(zhǔn)確性良好。

2.4 不同加工方法亳白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜 將10批亳白芍傳統(tǒng)片(A1—A10)高效液相色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版)》(2010國家藥典委員會)，以A1為參照圖譜，時(shí)間窗設(shè)為1.0，多點(diǎn)校正，自動匹配后以中位數(shù)法生成對照圖譜，標(biāo)記為A0，匹配圖譜見圖1，10批傳統(tǒng)片相對于A0的相似度見表3。后將10批亳白芍趁鮮片(B1—B10)及A0導(dǎo)入相似度評價(jià)系統(tǒng)，并以A0為參照圖譜，多點(diǎn)校正，自動匹配，匹配圖譜見圖2，并記錄B1—B10共10批樣品標(biāo)準(zhǔn)煎液相對于A0的相似度，見表3。白芍生斜片(C1—C10)圖譜處理同亳白芍趁鮮片，匹配圖譜見圖3，10批樣品相對于A0的相似度見表3。

3種亳白芍飲片各自10批樣品的對照圖譜(B1—B10的對照圖譜為B0，C1—C10的對照圖譜為C0)及混合對照液高效液相色譜圖見圖4，30批白芍樣品共有峰為23個(gè)，其中由對照品指認(rèn)7個(gè)，分別為3號峰(沒食子酸)、7號峰(氧化芍藥苷)、10號峰(芍藥內(nèi)酯苷)、11號峰(芍藥苷)、20號峰(苯甲酸)、21號峰(1,2,3,4,6-O-沒食子酰葡萄糖)和22號峰(苯甲酰芍藥苷)。亳白芍傳統(tǒng)片與亳白芍趁鮮片的高效液相色譜圖共有峰數(shù)量及大小相當(dāng)，而生斜片在芍藥內(nèi)酯苷(7號峰)與芍藥苷(10號峰)之間出現(xiàn)了一個(gè)小峰，其余峰的數(shù)量與傳統(tǒng)片相當(dāng)，部分峰的大小與亳白芍傳統(tǒng)片有差異。

對3種亳白芍飲片的指紋圖譜相似度進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，亳白芍傳統(tǒng)片和亳白芍趁鮮片指紋圖譜相似度均明顯高于亳白芍生斜片(P<0.05)，而亳白芍傳統(tǒng)片和亳白芍趁鮮片指紋圖譜相似度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，亳白芍趁鮮片與亳白芍傳統(tǒng)片內(nèi)在質(zhì)量相似度較高，而生斜片略低。

注：從下至上依次是A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A0的圖譜

圖1亳白芍傳統(tǒng)片(A1—A10)標(biāo)準(zhǔn)煎液高效液相色譜匹配圖及其對照品(A0)圖譜

注：從下至上依次是B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、A0的圖譜

圖2亳白芍趁鮮片(B1—B10)標(biāo)準(zhǔn)煎液高效液相色譜匹配圖及其對照品(A0)圖譜

注：從下至上依次是C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、A0的圖譜

圖3亳白芍生斜片(C1—C10)標(biāo)準(zhǔn)煎液高效液相色譜匹配圖及其對照品(A0)圖譜

注：3.沒食子酸；7.氧化芍藥苷；10.芍藥內(nèi)酯苷；11.芍藥苷；20.苯甲酸；21. 1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖；22.苯甲酰芍藥苷

圖4 3種加工方式亳白芍飲片高效液相指紋圖譜

注：與亳白芍生斜片比較，*P<0.05

對30批亳白芍樣品的共有峰相對峰面積以組間聯(lián)接平方歐氏距離法進(jìn)行聚類，聚類分析結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，亳白芍趁鮮片與傳統(tǒng)片聚為一類，亳白芍生斜片聚為一類，與相似度對比結(jié)果一致。

圖5 不同加工方式亳白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)煎液聚類分析樹狀圖

2.5 亳白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液中7種成分含量測定 取3種不同加工方式亳白芍飲片20 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中7種指標(biāo)性成分含量，結(jié)果見表4。單因素方差分析結(jié)果表明，3種亳白芍飲片中氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；亳白芍趁鮮片中芍藥苷與沒食子酸含量均明顯高于傳統(tǒng)片和生斜片(P<0.05)；3種亳白芍飲片中苯甲酸含量比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，亳白芍生斜片中苯甲酸含量最高，亳白芍傳統(tǒng)片中苯甲酸含量最低；亳白芍生斜片中1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖及苯甲酰芍藥苷含量均明顯低于傳統(tǒng)片及趁鮮片(P<0.05)。結(jié)果提示，亳白芍趁鮮片中7種成分與亳白芍傳統(tǒng)片中7種成分含量差異較小，而白芍生斜片中各成分含量與傳統(tǒng)片差異較大，此結(jié)果與指紋圖譜及聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

對于白芍的研究大多集中在醇提液，極少對直接應(yīng)用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行研究，本研究選用標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行研究，標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備參考中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略中標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法，使用玻璃器皿提取，提取過程使用冷凝設(shè)備進(jìn)行回流，提高提取效率[8]。且本研究將指紋圖譜與含量測定相結(jié)合，既對其中的主要成分進(jìn)行定量，又兼顧中藥發(fā)揮藥效的整體性，更能準(zhǔn)確評價(jià)白芍質(zhì)量。

表4 不同加工方式亳白芍標(biāo)準(zhǔn)煎液7種成分含量

注：與亳白芍傳統(tǒng)片比較，*P<0.05；與亳白芍趁鮮片比較，#P<0.05

亳白芍生斜片中除被視為無效成分甚至有害成分的苯甲酸較高外，其余6種成分含量均低于白芍傳統(tǒng)片，說明煮制可升高白芍中多種成分含量，同時(shí)又可降低白芍中苯甲酸含量[9-10]。在海外廣泛應(yīng)用的亳白芍生斜片的藥效及其藥效基礎(chǔ)尚不甚清晰，其能否同白芍傳統(tǒng)片一并應(yīng)用于臨床尚需進(jìn)一步研究。

在白芍主產(chǎn)地推廣產(chǎn)地加工與炮制一體化加工模式，將分散無序的藥農(nóng)或作坊式加工模式轉(zhuǎn)變?yōu)榻y(tǒng)一在企業(yè)進(jìn)行加工，使白芍加工更加規(guī)范，有利于提高白芍飲片質(zhì)量[11]。從指紋圖譜和多種成分含量的比較來看，亳白芍趁鮮片質(zhì)量并不低于亳白芍傳統(tǒng)片，但相關(guān)規(guī)定中暫未將其趁鮮加工合法化，阻礙了趁鮮加工及產(chǎn)地加工與炮制一體化技術(shù)的發(fā)展。

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