抵抗素樣分子β對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

李宇林 （廣安市人民醫(yī)院心內(nèi)科，四川 廣安 638500）

急性冠狀動脈綜合征（ACS）是一種起始表現(xiàn)為冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，進而誘導(dǎo)完全或不完全閉塞性血栓形成為病例基礎(chǔ)的心血管疾?。?-2］。加強對動脈粥樣硬化斑塊的研究學(xué)習(xí)對ACS的防護和根治具有深遠(yuǎn)的意義。斑塊的穩(wěn)定性是由許多原因造成的，細(xì)胞外表面存在的脂質(zhì)池越小，炎性細(xì)胞數(shù)量越少，纖維帽的厚度越大，斑塊的穩(wěn)定性就越高［3］。其中斑塊內(nèi)的炎性反應(yīng)是造成斑塊不穩(wěn)定性的首屈一指的影響因素［4］。炎性反應(yīng)程度越強烈，進程越遠(yuǎn)，其斑塊的破裂幾率就會越大。目前，控制斑塊淺表部位炎性反應(yīng)的發(fā)生率成為穩(wěn)定易損斑塊進而降低ACS發(fā)生率的研究熱點。抵抗素是一種經(jīng)過參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和代謝有關(guān)的酶來控制人體代謝過程的多肽類激素［5］。近年來，相關(guān)抵研究報道顯示，抵抗素存在于外周血單核細(xì)胞中，并且大量分泌同時還被多個炎性反應(yīng)標(biāo)志物所標(biāo)識，提醒研究者一個重要的信號，那就是所有的抵抗素作為一種已經(jīng)在機體中表達過的、現(xiàn)在以潛藏的形式存在于外周血中，其作為誘導(dǎo)因素可再次參與炎性反應(yīng)過程［6-7］。為了進一步了解抵抗素影響炎性因子參與過程的機制，深入研究動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響因素，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型的建立與分組：雄性ApoE小鼠普通飲食2周之后繼續(xù)給予高脂飲食（0.25%膽固醇 ＋15%脂肪）喂養(yǎng)2周。向小鼠腹腔內(nèi)注射0.08%戊巴比妥鈉進行麻醉，查看小鼠的麻醉效果，待其充分麻醉后把小鼠用結(jié)實的繃帶牢牢地固定在手術(shù)臺上，于頸部正中切口，把右側(cè)頸部肌肉及腺體分離出來，將右側(cè)頸總動脈完全暴露出來，用硅膠管套（長度為3 mm，內(nèi)徑為0.3 mm）放在頸總動脈旁邊，鎖定套管后縫合切口繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后，對頸總動脈進行局部暴露然后摘除硅膠套管，避免破壞小鼠組織。向頸總動脈處小心滴注100μl濃度為2×10 TU／ml的病毒懸液，局部孵育15 min后將切口縫合，這樣小鼠就受到不同程度的慢性病毒感染。轉(zhuǎn)染慢病毒的程度有PBS浸潤 、轉(zhuǎn)染攜帶空載體的慢病毒、轉(zhuǎn)染攜帶干擾序列Si-RELM的慢病毒。根據(jù)三種不同狀態(tài)依次對應(yīng)分為正常對照組、Si-NC組和Si-RELMβ組，每組20只。繼續(xù)進行為期4周的高脂喂養(yǎng) ，最終對小鼠行安樂死，收集血液及頸總動脈標(biāo)本用作檢驗。

1.2 各組體質(zhì)量和血脂的檢測：所有小鼠處死前三次測量體重，取平均值記錄并留樣空腹血。用Microfuge系列臺式微量離心機（Microfuge 20／20R）進行離心，取上層血清，檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）以及低密度脂蛋白膽固醇（LDL）的濃度。

1.3 方法：斑塊中RELMβ蛋白的表達水平選擇常見的Western blotting法對其測定。取一些冰塊使50 mg新鮮的頸動脈血處于低溫環(huán)境并將血剪碎，將500μl的Western裂解液滴入剪碎的新鮮血中，再繼續(xù)向其滴加5μl的蛋白酶抑制劑。三者均勻混合后在4℃冰上孵育30 min，在12 000 r／min轉(zhuǎn)速下將血液進行離心15 min。各組均取等量的總蛋白加入10%SDS-PAGE進行電泳分離（200 mA轉(zhuǎn)膜2 h），染色并鑒定轉(zhuǎn)膜效果。將5%脫脂奶粉置于室溫下封閉2 h，分別加入小鼠來源單抗抗體（1∶1 000），兔來源單抗使用 β-action抗體（1∶1 000），4℃孵育一晚，第2天用1×TBS-T溶液漂洗3次，15 min／次。加入由相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000），室溫條件下培育2 h，1×TBS-T溶液漂洗3次，15 min／次。暗室發(fā)光，應(yīng)用Photoshop技術(shù)、膠片曝光顯影進行半定量分析。分析進程中選β-action作為內(nèi)參照物，應(yīng)用目的蛋白和β-action的灰度比來表示蛋白相對表達水平。

1.4 平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、1L-1β、1L-6含量的檢測：分別選用生理鹽水、濃度為4%的多聚甲醛溶液灌洗心血管，使其保持固定狀態(tài)。小心地剝開并分離出右側(cè)頸總動脈，放于4%的多聚甲醛溶液中浸泡24 h，設(shè)定-80℃條件，將被OTC沖洗過的包埋組織凍存。截取5μm頸動脈斑塊組織做切片標(biāo)本并進行相應(yīng)的指標(biāo)（斑塊內(nèi)脂質(zhì)、膠原含量）測定，使用到的檢測方法依次是油紅染色檢測法和天狼猩紅染色法。冰凍切片室溫晾片20 min，雙蒸水浸泡10 min，PBS沖洗3次，每次沖洗5 min，用3%的雙氧水將切片浸泡10 min，然后用PBS反復(fù)沖洗。緊接著取濃度為5%的山羊血清封存20 min后加兔抗小鼠平滑肌細(xì)胞、大鼠抗小鼠巨噬細(xì)胞、兔抗小鼠1L-1β一抗、兔抗小鼠1L-6一抗9（1∶1 000），控制溫度在4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，沖洗時間5 min／次，滴加相應(yīng)的二抗，37℃孵育40 min，洗片后DAB染色Harris蘇木素染核，此操作應(yīng)避光。脫水透明后封片。ImaginPro Plus6.0檢測顯色面積，利用公式進行易損指數(shù)的計算＝（m脂質(zhì)＋Q巨噬細(xì)胞）／（Q膠原 ＋Q平滑肌細(xì)胞），其中Q表示某物質(zhì)的含量，進一步計算易損指數(shù)／斑塊總面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：采用專門進行數(shù)據(jù)處理的SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件（IBM SPSSStatistics），計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較不同試驗組別相互之間的不同程度，采用單一因素的方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染的效率：與正常對照組比較，Si-RELMβ組蛋白表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Si-NC組沒有明顯不同，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組體重的變化及血脂水平的表達：各組體重、TC、TG、LDL和HDL蛋白全都沒有明顯不同，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 REMLβ影響斑塊穩(wěn)定性的程度：與正常對照組相比，Si-RELMβ組內(nèi)膠原和平滑肌細(xì)胞的總量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Si-RELMβ對斑塊內(nèi)炎性因子表達的影響：Si-RELMβ組頸動脈斑塊內(nèi)IL-1及IL-6表達與正常對照組相比有顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SI-NC組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組體重、TC、TG、LDL、HDL水平比較（x±s，n＝20）

3 討論

急性冠狀動脈綜合征（ACS）是以一種十分常見的心血管疾病，尤其是在老年人群中多見，臨床表現(xiàn)為起始冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，進一步轉(zhuǎn)為不完全性或完全性的閉塞性血栓［8］。斑塊的穩(wěn)定性是由許多因素決定的，細(xì)胞外脂質(zhì)池越小，炎性細(xì)胞數(shù)量越少，纖維帽越厚斑塊的穩(wěn)定性越高。因此，斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)的多少是造成斑塊不穩(wěn)定性的首要因素。斑塊的破裂與炎性反應(yīng)的發(fā)展進程關(guān)聯(lián)緊密。

RELMβ廣泛存在于在心肺及腎等多種器官，尤其是巨噬細(xì)胞白介素-6細(xì)胞（IL-6）等炎性反應(yīng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。由此可知，RELMβ極有可能是參與動脈粥樣硬化斑塊炎性反應(yīng)過程中的一部分，影響斑塊穩(wěn)定性。本實驗結(jié)果顯示，慢性病毒感染轉(zhuǎn)為安全的時候無顯著變化。Western blotting顯色反應(yīng)表明攜帶RELMβ干擾序列的慢性病毒感染后，抵抗素樣分子表達顯著降低，表明感染成功且干擾的效率高。利用小鼠頸總動脈套管＋高脂肪喂食的方法作為研究ACS的常用模型，結(jié)果顯示RELMβ被干擾后存在于頸總動脈斑塊中平滑肌細(xì)胞的含量和膠原含量發(fā)生顯著變化，存在大大增加的現(xiàn)象，而斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及脂質(zhì)含量明顯減少。這說明干擾后的RELMβ能促進斑塊的形成，降低斑塊的易損指數(shù)。

綜上所述，炎性介質(zhì)是參與斑塊形成的重要因素，尤其是1L-1β、1L-6是關(guān)鍵的炎性反應(yīng)因子。既往研究發(fā)現(xiàn)，在消除了1L-1β、1L-6之后，ACS斑塊面積以及巨噬細(xì)胞含量均顯著減少足以說明1L-1β、1L-6在維持板塊穩(wěn)定性的重要作用。本實驗顯示，RELMβ干擾后的斑塊中，1L-1β、1L-6蛋白的含量減少，說明RELMβ有利于易損斑塊的形成。提示對ACS的防治研究可通過調(diào)節(jié)RELMβ的含量來控制斑塊的穩(wěn)定性。

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