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    抵抗素樣分子β對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響

    2018-04-24 10:01:24李宇林廣安市人民醫(yī)院心內(nèi)科四川廣安638500
    吉林醫(yī)學(xué) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:抵抗素性反應(yīng)斑塊

    李宇林 (廣安市人民醫(yī)院心內(nèi)科,四川 廣安 638500)

    急性冠狀動脈綜合征(ACS)是一種起始表現(xiàn)為冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂,進而誘導(dǎo)完全或不完全閉塞性血栓形成為病例基礎(chǔ)的心血管疾?。?-2]。加強對動脈粥樣硬化斑塊的研究學(xué)習(xí)對ACS的防護和根治具有深遠(yuǎn)的意義。斑塊的穩(wěn)定性是由許多原因造成的,細(xì)胞外表面存在的脂質(zhì)池越小,炎性細(xì)胞數(shù)量越少,纖維帽的厚度越大,斑塊的穩(wěn)定性就越高[3]。其中斑塊內(nèi)的炎性反應(yīng)是造成斑塊不穩(wěn)定性的首屈一指的影響因素[4]。炎性反應(yīng)程度越強烈,進程越遠(yuǎn),其斑塊的破裂幾率就會越大。目前,控制斑塊淺表部位炎性反應(yīng)的發(fā)生率成為穩(wěn)定易損斑塊進而降低ACS發(fā)生率的研究熱點。抵抗素是一種經(jīng)過參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和代謝有關(guān)的酶來控制人體代謝過程的多肽類激素[5]。近年來,相關(guān)抵研究報道顯示,抵抗素存在于外周血單核細(xì)胞中,并且大量分泌同時還被多個炎性反應(yīng)標(biāo)志物所標(biāo)識,提醒研究者一個重要的信號,那就是所有的抵抗素作為一種已經(jīng)在機體中表達過的、現(xiàn)在以潛藏的形式存在于外周血中,其作為誘導(dǎo)因素可再次參與炎性反應(yīng)過程[6-7]。為了進一步了解抵抗素影響炎性因子參與過程的機制,深入研究動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響因素,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 動物模型的建立與分組:雄性ApoE小鼠普通飲食2周之后繼續(xù)給予高脂飲食(0.25%膽固醇 +15%脂肪)喂養(yǎng)2周。向小鼠腹腔內(nèi)注射0.08%戊巴比妥鈉進行麻醉,查看小鼠的麻醉效果,待其充分麻醉后把小鼠用結(jié)實的繃帶牢牢地固定在手術(shù)臺上,于頸部正中切口,把右側(cè)頸部肌肉及腺體分離出來,將右側(cè)頸總動脈完全暴露出來,用硅膠管套(長度為3 mm,內(nèi)徑為0.3 mm)放在頸總動脈旁邊,鎖定套管后縫合切口繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后,對頸總動脈進行局部暴露然后摘除硅膠套管,避免破壞小鼠組織。向頸總動脈處小心滴注100μl濃度為2×10 TU/ml的病毒懸液,局部孵育15 min后將切口縫合,這樣小鼠就受到不同程度的慢性病毒感染。轉(zhuǎn)染慢病毒的程度有PBS浸潤 、轉(zhuǎn)染攜帶空載體的慢病毒、轉(zhuǎn)染攜帶干擾序列Si-RELM的慢病毒。根據(jù)三種不同狀態(tài)依次對應(yīng)分為正常對照組、Si-NC組和Si-RELMβ組,每組20只。繼續(xù)進行為期4周的高脂喂養(yǎng) ,最終對小鼠行安樂死,收集血液及頸總動脈標(biāo)本用作檢驗。

    1.2 各組體質(zhì)量和血脂的檢測:所有小鼠處死前三次測量體重,取平均值記錄并留樣空腹血。用Microfuge系列臺式微量離心機(Microfuge 20/20R)進行離心,取上層血清,檢測血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL)的濃度。

    1.3 方法:斑塊中RELMβ蛋白的表達水平選擇常見的Western blotting法對其測定。取一些冰塊使50 mg新鮮的頸動脈血處于低溫環(huán)境并將血剪碎,將500μl的Western裂解液滴入剪碎的新鮮血中,再繼續(xù)向其滴加5μl的蛋白酶抑制劑。三者均勻混合后在4℃冰上孵育30 min,在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下將血液進行離心15 min。各組均取等量的總蛋白加入10%SDS-PAGE進行電泳分離(200 mA轉(zhuǎn)膜2 h),染色并鑒定轉(zhuǎn)膜效果。將5%脫脂奶粉置于室溫下封閉2 h,分別加入小鼠來源單抗抗體(1∶1 000),兔來源單抗使用 β-action抗體(1∶1 000),4℃孵育一晚,第2天用1×TBS-T溶液漂洗3次,15 min/次。加入由相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000),室溫條件下培育2 h,1×TBS-T溶液漂洗3次,15 min/次。暗室發(fā)光,應(yīng)用Photoshop技術(shù)、膠片曝光顯影進行半定量分析。分析進程中選β-action作為內(nèi)參照物,應(yīng)用目的蛋白和β-action的灰度比來表示蛋白相對表達水平。

    1.4 平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、1L-1β、1L-6含量的檢測:分別選用生理鹽水、濃度為4%的多聚甲醛溶液灌洗心血管,使其保持固定狀態(tài)。小心地剝開并分離出右側(cè)頸總動脈,放于4%的多聚甲醛溶液中浸泡24 h,設(shè)定-80℃條件,將被OTC沖洗過的包埋組織凍存。截取5μm頸動脈斑塊組織做切片標(biāo)本并進行相應(yīng)的指標(biāo)(斑塊內(nèi)脂質(zhì)、膠原含量)測定,使用到的檢測方法依次是油紅染色檢測法和天狼猩紅染色法。冰凍切片室溫晾片20 min,雙蒸水浸泡10 min,PBS沖洗3次,每次沖洗5 min,用3%的雙氧水將切片浸泡10 min,然后用PBS反復(fù)沖洗。緊接著取濃度為5%的山羊血清封存20 min后加兔抗小鼠平滑肌細(xì)胞、大鼠抗小鼠巨噬細(xì)胞、兔抗小鼠1L-1β一抗、兔抗小鼠1L-6一抗9(1∶1 000),控制溫度在4℃孵育過夜。PBS沖洗3次,沖洗時間5 min/次,滴加相應(yīng)的二抗,37℃孵育40 min,洗片后DAB染色Harris蘇木素染核,此操作應(yīng)避光。脫水透明后封片。ImaginPro Plus6.0檢測顯色面積,利用公式進行易損指數(shù)的計算=(m脂質(zhì)+Q巨噬細(xì)胞)/(Q膠原 +Q平滑肌細(xì)胞),其中Q表示某物質(zhì)的含量,進一步計算易損指數(shù)/斑塊總面積。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理:采用專門進行數(shù)據(jù)處理的SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件(IBM SPSSStatistics),計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,比較不同試驗組別相互之間的不同程度,采用單一因素的方差分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 慢病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)染的效率:與正常對照組比較,Si-RELMβ組蛋白表達明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Si-NC組沒有明顯不同,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 各組體重的變化及血脂水平的表達:各組體重、TC、TG、LDL和HDL蛋白全都沒有明顯不同,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    2.3 REMLβ影響斑塊穩(wěn)定性的程度:與正常對照組相比,Si-RELMβ組內(nèi)膠原和平滑肌細(xì)胞的總量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4 Si-RELMβ對斑塊內(nèi)炎性因子表達的影響:Si-RELMβ組頸動脈斑塊內(nèi)IL-1及IL-6表達與正常對照組相比有顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SI-NC組與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 各組體重、TC、TG、LDL、HDL水平比較(x±s,n=20)

    3 討論

    急性冠狀動脈綜合征(ACS)是以一種十分常見的心血管疾病,尤其是在老年人群中多見,臨床表現(xiàn)為起始冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂,進一步轉(zhuǎn)為不完全性或完全性的閉塞性血栓[8]。斑塊的穩(wěn)定性是由許多因素決定的,細(xì)胞外脂質(zhì)池越小,炎性細(xì)胞數(shù)量越少,纖維帽越厚斑塊的穩(wěn)定性越高。因此,斑塊內(nèi)炎性反應(yīng)的多少是造成斑塊不穩(wěn)定性的首要因素。斑塊的破裂與炎性反應(yīng)的發(fā)展進程關(guān)聯(lián)緊密。

    RELMβ廣泛存在于在心肺及腎等多種器官,尤其是巨噬細(xì)胞白介素-6細(xì)胞(IL-6)等炎性反應(yīng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。由此可知,RELMβ極有可能是參與動脈粥樣硬化斑塊炎性反應(yīng)過程中的一部分,影響斑塊穩(wěn)定性。本實驗結(jié)果顯示,慢性病毒感染轉(zhuǎn)為安全的時候無顯著變化。Western blotting顯色反應(yīng)表明攜帶RELMβ干擾序列的慢性病毒感染后,抵抗素樣分子表達顯著降低,表明感染成功且干擾的效率高。利用小鼠頸總動脈套管+高脂肪喂食的方法作為研究ACS的常用模型,結(jié)果顯示RELMβ被干擾后存在于頸總動脈斑塊中平滑肌細(xì)胞的含量和膠原含量發(fā)生顯著變化,存在大大增加的現(xiàn)象,而斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞及脂質(zhì)含量明顯減少。這說明干擾后的RELMβ能促進斑塊的形成,降低斑塊的易損指數(shù)。

    綜上所述,炎性介質(zhì)是參與斑塊形成的重要因素,尤其是1L-1β、1L-6是關(guān)鍵的炎性反應(yīng)因子。既往研究發(fā)現(xiàn),在消除了1L-1β、1L-6之后,ACS斑塊面積以及巨噬細(xì)胞含量均顯著減少足以說明1L-1β、1L-6在維持板塊穩(wěn)定性的重要作用。本實驗顯示,RELMβ干擾后的斑塊中,1L-1β、1L-6蛋白的含量減少,說明RELMβ有利于易損斑塊的形成。提示對ACS的防治研究可通過調(diào)節(jié)RELMβ的含量來控制斑塊的穩(wěn)定性。

    [1] 宋 瑩,許晶晶,唐曉芳,等.殘余SYNTAX積分對急性冠狀動脈綜合征介入治療預(yù)后分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2017,97(7):502.

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