不同pH值的40 mL/L磷酸鹽緩沖甲醛液固定乳腺癌組織對FISH法檢測HER2基因結(jié)果的影響

陳志強(qiáng)，米賢軍，陳 昂，段立鋒，劉超凡，鄧文同

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院病理科，廣東中山 528400)

乳腺癌是女性癌癥死亡的第二大原因，中國乳腺癌新發(fā)數(shù)量和死亡數(shù)量分別占全世界的12.2%和9.6%[1]。人類表皮生長因子受體2(human pidermal growth factor receptor 2, HER2)基因?qū)θ橄侔┑陌l(fā)生、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療有重要作用，檢測HER2基因具有重要的臨床價值。乳腺癌HER2檢測指南推薦采用熒光原位雜交(FISH)法檢測HER2基因狀態(tài)，F(xiàn)ISH法可作為其評判的金標(biāo)準(zhǔn)方法[2]。組織固定是影響FISH法檢測HER2基因結(jié)果的重要環(huán)節(jié)，也是保障實驗結(jié)果可靠穩(wěn)定的關(guān)鍵步驟之一。

盡管指南中明確推薦40 mL/L磷酸鹽緩沖甲醛作為固定液，但是在日常標(biāo)本的批量處理過程中，甲醛容易氧化成甲酸，使溶液pH值降低，有可能影響分子病理學(xué)的檢測結(jié)果。因此，探討甲醛溶液的實時pH狀態(tài)對于確保HER2基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和高度可重復(fù)性有重要意義。楊京平等[3]研究固定液pH值和抗原修復(fù)液pH值對免疫組化染色結(jié)果的影響，結(jié)果證實：pH值可直接影響滲透作用、滲透壓、染色強(qiáng)度及背景染色，選擇固定液的合適pH值，是提高標(biāo)本染色質(zhì)量的重要條件。MOATAMED等[4]研究結(jié)果證實，標(biāo)本離體1 h使用100 mL/L福爾馬林固定或者使用Bouin固定液，均可造成HER2檢測結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，關(guān)于固定液pH實時狀態(tài)對于乳腺癌HER2基因結(jié)果的影響，并未見大樣本病例的研究和公開報道。

本研究使用40 mL/L磷酸鹽緩沖甲醛液作為固定液，并在4種不同pH值狀態(tài)下固定乳腺原發(fā)性浸潤癌組織，用FISH法檢測HER2基因擴(kuò)增情況，觀察熒光顯微鏡下各組的大體情況并統(tǒng)計分析4組間陽性率的差異，為優(yōu)化HER2檢測過程中標(biāo)本的固定程序提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器HER2探針由中國北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供，為GLP HER2/CSP17探針。甲醛溶液為廣州市東紅化工廠生產(chǎn)。SAKURA Tissue Tek Vip-5全自動密閉式組織脫水機(jī)、DRS-2000J-D2全自動染色機(jī)(日本櫻花檢驗儀器株式會社)，Thermo HM325輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國Thermo)。尼康ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)。S500-24熒光原位雜交儀(美國Thermobrit公司)。

1.2標(biāo)本來源收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院2014年3月至2017年1月期間手術(shù)切除的乳腺原發(fā)性浸潤癌75例，年齡35～73歲，中位年齡為56歲，平均年齡55.6歲。所有患者術(shù)前未接受過任何輔助治療(靶向治療、放化療治療、內(nèi)分泌治療)，術(shù)后經(jīng)病理確診為乳腺原發(fā)性浸潤癌，根據(jù)2012版WHO乳腺腫瘤分類[5]，包括浸潤性導(dǎo)管癌71例，經(jīng)典型浸潤性小葉癌2例，篩狀癌1例，腺樣囊性癌1例。

1.3實驗分組與組織的不同處理方法同一腫瘤病變部位按照大小0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，取材4塊，按固定液pH不同隨機(jī)分為4組(A、B、C、D組)，即分別為pH 6.0、7.0、7.5、8.0組。固定液用40 mL/L磷酸鹽緩沖甲醛液，各組pH值分別為6.0、7.0、7.5、8.0(按照Na2HPO4和NaH2PO4的不同比例配制而成，用1 mol/L的HCl和3 g/L的NaOH校正pH值)。

各組分別應(yīng)用相應(yīng)pH值的固定液在室溫下固定15 h，在全自動組織脫水機(jī)中進(jìn)行組織處理。相關(guān)流程參閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[6]，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色。由2位 資深病理醫(yī)師確診為乳腺原發(fā)性浸潤癌。

1.4FISH法檢測HER2基因方法步驟參閱文獻(xiàn)[7]，于熒光顯微鏡下觀察，每張切片的檢測均設(shè)置陰性、陽性對照。

1.5熒光顯微鏡下的觀察及檢測結(jié)果的判定使用不同pH值的甲醛固定液處理，經(jīng)探針雜交后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的完整性、背景潔凈程度、探針信號數(shù)量和定位以及清晰度、是否影響其基因擴(kuò)增陽性率。

判讀標(biāo)準(zhǔn)參考2014版乳腺癌HER2檢測指南[2]：①當(dāng)HER2/CSP17比值≥2.0時，為HER2陽性；HER2/CSP17比值<2.0，但平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞≥6.0時也為HER2陽性；②HER2/CSP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0時為HER2陰性；③HER2/CSP17比值<2.0且平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<6.0，但≥4.0時為HER2 FISH結(jié)果不確定。對于FISH結(jié)果不確定的病例，需要再計算20個細(xì)胞核中的信號或由另外1位分析者重新計數(shù)。如仍為臨界值，則選取不同的組織塊重新檢測，直至區(qū)分出FISH結(jié)果的陰陽性。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理全部統(tǒng)計分析用SPSS 20.0完成。HER2基因擴(kuò)增陽性率是指HER2基因擴(kuò)增陽性例數(shù)占同期HER2基因檢測總例數(shù)的比例。組間HER2基因擴(kuò)增陽性率的差異用配對資料χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1熒光顯微鏡下的大體情況觀察結(jié)果在熒光顯微鏡下，A、D組的組織輪廓較模糊，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，部分探針定位欠佳，出現(xiàn)信號不規(guī)則甚至丟失，核溶解現(xiàn)象，見明亮的桔紅/綠熒光信號。B、C組的組織輪廓清晰而完整、背景潔凈、探針定位準(zhǔn)確，見耀眼的桔紅/綠熒光信號。細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色呈深藍(lán)色熒光，HER2探針被四甲基羅丹明標(biāo)記激發(fā)呈桔紅色熒光，CSP17探針被異硫氰酸熒光素標(biāo)記激發(fā)呈綠色熒光(圖1)。

圖1浸潤性乳腺癌HER2基因雙探針FISH圖像

Fig.1 FISH images of HER2 gene in infiltrating breast cancer (×1 000)

A：A組病例中HER2基因陰性圖像；B：B組病例中HER2基因陰性圖像；C：C組病例中HER2基因陽性圖像；D：D組病例中HER2基因陽性圖像。

2.2HER2基因擴(kuò)增結(jié)果的比較B、C組HER2基因擴(kuò)增的陽性率顯著高于A、D組(P<0.05，表1)。說明采用FISH法檢測乳腺原發(fā)性浸潤癌HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)，固定液的pH值在7.0～7.5之間可獲得可靠的檢測結(jié)果。

表1不同pH值的40mL/L磷酸鹽緩沖甲醛固定乳腺癌組織的HER2基因擴(kuò)增結(jié)果

Tab.1 The amplification results of HER2 gene fixed with 40 mL/L neutral buffered formaldehyde of different pH values (n=75)

組別陰性(n)陽性(n)陽性率(%)A651013．33?B571824．00C561925．33D631216．00?

與B、C組比較，*P<0.05。

3 討 論

HER2是一種酪氨酸激酶-人類表皮生長因子受體，在20%～30%的浸潤性乳腺癌患者中有HER2基因擴(kuò)增[1]，HER2陽性是乳腺癌的最激進(jìn)亞型，此類乳腺癌浸潤性強(qiáng)、生存期短、預(yù)后差，對激素治療和常規(guī)化療不敏感。曲妥珠單抗能選擇性地作用于HER2細(xì)胞外部，對HER2基因擴(kuò)增的乳腺癌有較好的療效。因此，明確HER2基因狀態(tài)，可以準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后，并能指導(dǎo)臨床合理選擇治療藥物。FISH法檢測HER2基因擴(kuò)增水平，因其敏感性高、穩(wěn)定性好，在病理檢測中被廣泛應(yīng)用[2]。然而，F(xiàn)ISH法操作過程步驟較多、不穩(wěn)定性因素增加、檢測結(jié)果易受到諸多因素的影響，其中最主要的影響因素是組織處理環(huán)節(jié)，是實驗室間檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可重復(fù)性的主要影響因素[4]。

在組織固定處理程序中，40 mL/L緩沖甲醛溶液是應(yīng)用最為廣泛的固定液，其固定原理是形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。固定液pH值對于組織的固定來說非常重要，pH值過高或者過低易引起組織內(nèi)形成廣泛的蛋白質(zhì)交聯(lián)、DNA斷裂，阻礙核酸的提取并局限了DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的提取效率[8-10]。因此，探索恰當(dāng)?shù)膒H值，對HER2的FISH檢測具有重要的臨床價值。

本研究應(yīng)用FISH法檢測75例乳腺原發(fā)性浸潤癌中HER2基因擴(kuò)增水平，重點觀察使用4種不同pH值的40 mL/L緩沖甲醛固定液對檢測HER2基因擴(kuò)增效果的影響。結(jié)合熒光顯微鏡下情況分析，B、C組的組織輪廓的完整性、背景潔凈程度、探針信號數(shù)量以及清晰度等觀察指標(biāo)均明顯優(yōu)于A、D組；B或C組的基因擴(kuò)增陽性率分別顯著高于A或D組(P<0.05)。分析原因，認(rèn)為固定液的pH值在6.0的A組由于pH值太低，分子間聚合作用加快，阻礙了DNA的固定，使固定效果急驟下降,直接影響了HER2基因FISH檢測效果。相反pH值為8.0的D組，由于pH值太高，破壞了DNA片段，導(dǎo)致DNA斷裂，造成HER2基因檢測效果差。而固定液的pH值在7.0～7.5間的B、C組，pH值適中，組織固定充分而恰當(dāng)，DNA保護(hù)較好。HER2基因擴(kuò)增陽性率基本穩(wěn)定在24.00%～25.33%，與RAKHA等[1]研究證實在20%～30%的原發(fā)性浸潤性乳腺癌中有HER2基因擴(kuò)增和蛋白的過表達(dá)結(jié)果一致；與張虹等[11]運用FISH法對348例浸潤性乳腺癌的HER2狀態(tài)進(jìn)行檢測，其陽性率為23.52%基本一致。說明B、C組的HER2基因檢測結(jié)果穩(wěn)定而真實可靠，實驗結(jié)論具有重要的臨床參考價值。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時代的到來，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果已成為疾病靶向治療的重要依據(jù)。HER2基因檢測FISH與乳腺、卵巢、肺、肝等多種癌癥的精準(zhǔn)治療密切相關(guān)。而組織處理中的固定環(huán)節(jié)(恰當(dāng)?shù)墓潭ㄒ杭皃H值、固定時間與固定液類型等)決定著FISH法的檢測效果。因此，以標(biāo)準(zhǔn)化的固定程序帶動HER2檢測質(zhì)量的提高是本研究的初衷，并期待能進(jìn)一步確保HER2基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性?？上驳氖牵趪鴥?nèi)病理學(xué)專家的共同努力下，我國乳腺癌、胃癌的HER2檢測工作日趨成熟。至于此研究結(jié)論是否適用于其他腫瘤組織的HER2基因檢測中，是否適用于免疫組織化學(xué)等相關(guān)病理技術(shù)中，還有待以后的大樣本資料研究進(jìn)一步驗證。

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