長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00467促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖

裴 振，霍小蕾，田向陽(yáng)，張毅強(qiáng)，賈建桃，韓玲娜

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院：1. 生理學(xué)教研室；2. 組織胚胎學(xué)教研室；3. 附屬和平醫(yī)院；4. 生化教研室；5.病理生理學(xué)教研室，山西長(zhǎng)治 046000)

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，全世界每年約有180萬(wàn)新發(fā)病例[1]。肺癌根據(jù)病理學(xué)形態(tài)和臨床特征又可分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，其中NSCLC患者約占80%～85%[2-3]。目前，NSCLC的治療手段仍然是以手術(shù)治療為主。隨著治療技術(shù)的日臻成熟，盡管治療方法有較大改進(jìn)，但是NSCLC的5年生存率仍然不能令人滿(mǎn)意，僅為15%[4-5]。因此，亟需一種新的NSCLC治療靶標(biāo)，以更好監(jiān)測(cè)其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等病程。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, LncRNA)是一類(lèi)近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)與多種疾病密切相關(guān)的分子[6-7]。LncRNAs可定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)或者特定亞細(xì)胞器上，其定位與其行使的功能密切相關(guān)[8]。研究顯示，LncRNA家族分子LINC00467(long intergenic non-protein coding RNA 467)在調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌和肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[9-11]。然而，LncRNA-LINC00467在NSCLC中的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)LINC00467在NSCLC中的表達(dá)、定位及分子調(diào)控方式，初步探究LINC00467對(duì)NSCLC生物學(xué)行為的作用機(jī)制，為其分子治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料Trizol試劑和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScriptⅡRT Kit，#218161)購(gòu)于QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(reverse transcription system，#A3500)購(gòu)于Promega公司；LipofectAMINE 2 000購(gòu)買(mǎi)于Invitrogen公司；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)、CCK8試劑購(gòu)于碧云天生物科技公司；細(xì)胞漿/核RNA抽提試劑盒(PARISTMKit Protein and RNA Isolation system)購(gòu)于Ambion生物公司；CyclinD1、CDK6和GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)購(gòu)于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；siRNA片段購(gòu)于廣州瑞博生物有限公司。

1.2方法

1.2.1一般資料 收集25例長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院腫瘤科自2014年12月至2016年1月NSCLC患者經(jīng)手術(shù)切除的組織，包括癌組織和癌旁組織(癌周3 cm以上)?；颊吣挲g35～75歲，平均(55.23±3.45)歲?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行放化療和生物治療、未合并其他腫瘤等，均可完整收集患者的檢查、治療和手術(shù)資料以及聯(lián)系方式等。標(biāo)本首先置于液氮灌中10 min，然后取出放于-80 ℃保存用于抽提RNA，行qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA-LINC00467的表達(dá)情況。

高通量基因表達(dá)(GEO)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE19804和GSE18842數(shù)據(jù)集在PubMed GEO DataSets主頁(yè)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)下載獲得，這兩個(gè)數(shù)據(jù)集的平臺(tái)來(lái)源為GPL570，其基因表達(dá)譜芯片分析均采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，LINC00467對(duì)應(yīng)的探針號(hào)為224443_at。GSE19804中包含60對(duì)人NSCLC患者癌組織及癌旁組織，GSE18842中包含正常人肺組織45例，NSCLC組織46例。

1.2.2細(xì)胞系 人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE及人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H266、NCI-H1299均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。HBE、A549、NCI-H266和H1299細(xì)胞所用培養(yǎng)液為含100 mL/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培基，細(xì)胞保持在37 ℃、50 mL/L CO2的潮濕環(huán)境中。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種于6孔板中(按1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔)，用對(duì)照序列negative control sequence(si-NC)和si-LINC00467(5 μmol/L)干擾試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體步驟參照LipofectamineTM轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2 000試劑盒說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染36 h后，收集細(xì)胞及上清進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。相應(yīng)siRNA片段的序列分別為：si-LINC00467-1：5′-GAAGAAGAGAAGAGAGAAA-3′；si-LINC00467-2：5′-GATAAGAAGTCCACTCACA-3′；si-NC：siN05815122147。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)LINC00467、CyclinD1和CDK6 mRNA表達(dá)采用Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)。引物序列如下：LncRNA-LINC00467 mRNA的正向引物為5′-ATTGAAGATGCTGCCAAGGG-3′，反向引物為5′-GCCCAGTTTCAGTCCCTCTT-3′；CyclinD1 mRNA的正向引物為5′-TCGTTGCCCTCTGTGCCACA-3′，反向引物為5′-GCAGTCCGGGTCACACTTGA-3′；CDK6 mRNA的正向引物為5′-CCAGATGGCTCTAACCTCAGT-3′，反向引物為5′-AACTTCCACGAAAAAGAGGCTT-3′；U6(細(xì)胞核的參照物) mRNA的正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；18S(細(xì)胞質(zhì)的參照物)mRNA的正向引物為5′-GTGGGCCGAAGATATGCTCA-3′，反向引物為5′-TTGGCTAGGACCTGGCTGTA-3′；GAPDH(細(xì)胞質(zhì)的參照物)mRNA的正向引物為5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，反向引物為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。引物根據(jù)GenBank序列，用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.22設(shè)計(jì)，由華大基因生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，隨后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.2.5CCK8檢測(cè)LINC00467 siRNA對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 各組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行相應(yīng)的處理后。各板加入100 μL混合培養(yǎng)液(90 μL聯(lián)合培養(yǎng)基+10 μL CCK8溶液/孔)，在37 ℃孵育長(zhǎng)達(dá)2 h，應(yīng)用SpectraMax 190光吸收酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)測(cè)定450 nm處的吸光度并進(jìn)行分析。

1.2.6克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00467 siRNA對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 各組細(xì)胞按每孔1 000個(gè)細(xì)胞分別接種于6孔板中，培養(yǎng)約15 d后，肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)即終止培養(yǎng)。PBS磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，10 g/L結(jié)晶紫染液染色10 min，晾干，拍照。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7細(xì)胞周期分析檢測(cè)LINC00467 siRNA對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 收集細(xì)胞并用700 mL/L的冷乙醇固定，4 ℃過(guò)夜。碘化丙啶(0.05 mg/mL)和RNA酶(2 mg/mL)常溫下染色30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，細(xì)胞周期(G0/G1、S和G2/M期)百分比的評(píng)估使用Cell Lab Quanta SC軟件。

1.2.8細(xì)胞核/質(zhì)RNA分離及檢測(cè)LINC00467在細(xì)胞核/質(zhì)定位 收集約1×106細(xì)胞數(shù)量的A549細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，離心，重懸，再將細(xì)胞分成2份(一份抽提總RNA，一份抽提核/質(zhì)RNA)?？俁NA的抽提采用Trizol法，細(xì)胞質(zhì)/核RNA的抽提步驟參考胞質(zhì)/核RNA抽提試劑盒(PARISTM Kit Protein and RNA Isolation system)說(shuō)明書(shū)。將qRT-PCR法測(cè)得的細(xì)胞核RNA樣本中LncRNA-LINC00467、U6、GAPDH、18S基因表達(dá)量減去各基因在總RNA樣本中的表達(dá)量，得到△Ct，計(jì)算2-△Ct，進(jìn)行Lg(2-△Ct)轉(zhuǎn)換即得到最終的表達(dá)值[12]。當(dāng)LINC00467表達(dá)量大于0時(shí)，即表示該分子主要分布在細(xì)胞核中；反之，當(dāng)LINC00467表達(dá)量小于0時(shí)，在橫坐標(biāo)下方，即表示該分子主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

1.2.9Western blot蛋白免疫印跡分析檢測(cè)LINC00467 siRNA對(duì)細(xì)胞周期分子Cyclin D1和CDK6蛋白表達(dá)的影響 處理細(xì)胞后，用RIPA裂解液(強(qiáng))冰上裂解細(xì)胞30 min，20 W超聲振蕩2 min，在4 ℃條件下，12 000 g離心10 min，收集上清，檢測(cè)蛋白濃度。50 μg待測(cè)蛋白在100 g/L的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，電泳條件為積層膠80 V 40 min、分離膠120 V 1.5 h 90 min，然后在100 V的條件下濕轉(zhuǎn)膜1.5 h 90 min，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(Cyclin D1和CDK6一抗的稀釋比例1∶500，GAPDH一抗的稀釋比例1∶1 000)，洗膜，二抗37 ℃孵育1 h，洗膜，顯影。用Scion Image軟件進(jìn)行條帶的灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA-LINC00467在NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)通過(guò)提取GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)GSE19804和GSE18842數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)資料，分析LINC00467在NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：在GSE19804和GSE18842數(shù)據(jù)集中，LINC00467在NSCLC組織中的表達(dá)高于正常肺組織(P均<0.05，圖1)。

圖1GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析LINC00467在NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)

Fig.1 The level ofLINC00467 expression in NSCLC tissues and normal lung tissues analyzed by GEO database

2.2LncRNA-LINC00467在NSCLC組織和NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)及定位為了更進(jìn)一步明確LncRNA-LINC00467在NSCLC中的表達(dá)情況，我們通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)25對(duì)人NSCLC組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織。結(jié)果顯示，相對(duì)于癌旁正常組織，LINC00467在NSCLC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)(n=25，P<0.01，圖2)；qRT-PCR法檢測(cè)肺正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE和NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H266和NCI-H1299中LINC00467的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，LINC00467在NSCLC細(xì)胞的表達(dá)顯著高于正常支氣管上皮細(xì)胞系HBE(n=3，P<0.05，圖3)，其中，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中LINC00467的表達(dá)最高。此外，試劑盒抽提分離A549細(xì)胞的細(xì)胞核RNA和細(xì)胞質(zhì)RNA后，行qRT-PCR法檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞核/質(zhì)指標(biāo)，結(jié)果顯示LINC00467主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖4)，提示其LINC00467可能在細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮調(diào)控某些基因轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平的功能。

圖2qRT-PCR法檢測(cè)LINC00467在NSCLC癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

Fig.2 The expression ofLINC00467 in NSCLC cancer tissues and adjacent normal tissues detected by qRT-PCR (n=25)

2.3驗(yàn)證LncRNA-LINC00467si-RNA在A549細(xì)胞中的抑制效率LINC00467 si-RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞48 h后，qRT-PCR結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-LINC00467-1和si-LINC00467-2組的細(xì)胞LINC00467基因的表達(dá)水平均受到抑制(n=3，P均<0.05)，轉(zhuǎn)染si-LINC00467-1+2組的細(xì)胞LINC00467的抑制程度尤為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.01，圖5)。

圖3qRT-PCR法檢測(cè)LINC00467在NSCLC癌細(xì)胞中的表達(dá)

Fig.3 The expression ofLINC00467 in NSCLC detected by qRT-PCR (n=3)

圖4qRT-PCR法檢測(cè)LINC00467在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中的定位情況

Fig.4 The location ofLINC00467 in NSCLC of A549 cells detected by qRT-PCR

注：表達(dá)量在橫坐標(biāo)上方即表示該分子主要分布在細(xì)胞核中，表達(dá)量在橫坐標(biāo)下方即表示該分子主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

圖5qRT-PCR法檢測(cè)LINC00467si-RNA在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中的抑制效率

Fig.5 The inhibition efficiency ofLINC00467 si-RNA in NSCLC cell line A549

2.4沉默LncRNA-LINC00467表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響LINC00467 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組si-NC細(xì)胞相比，si-LINC00467組處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增多(P<0.01)，處于S期的細(xì)胞比例明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.01，圖6)；LINC00467 si-RNA轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞后培養(yǎng)15 d，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-LINC00467細(xì)胞組相對(duì)于si-NC組，細(xì)胞克隆形成明顯受到了抑制，且克隆數(shù)量明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P<0.01，圖7)；此外，CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染96 h后，si-LINC00467細(xì)胞組相對(duì)于si-NC組的細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5，P<0.01，圖8)。提示，沉默LncRNA-LINC00467表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力。

圖6流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00467si-RNA對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

Fig.6 Effects ofLINC00467 si-RNA on cell-cycle distribution detected by flow cytometry

圖7細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00467si-RNA對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響

Fig.7 Clone formation experiment to detect the effect ofLINC00467 si-RNA on cell clone formation

2.5沉默LncRNA-LINC00467表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞周期分子表達(dá)的影響LINC00467 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞48 h后收集相應(yīng)的RNA和蛋白質(zhì)，qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組si-NC細(xì)胞相比，si-LINC00467細(xì)胞組中LINC00467、G1/S-特異性周期蛋白-D1(CyclinD1)和細(xì)胞周期分子細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶(CDK6)的表達(dá)水平均受到了不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P均<0.05，圖9)；Western blot法檢測(cè)結(jié)果也同樣表明，si-LINC00467細(xì)胞組相對(duì)于si-NC組CyclinD1和CDK6的蛋白表達(dá)量減少，灰度分析顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，P均<0.05，圖10)。

圖8CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC00467si-RNA對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

Fig.8 Effects ofLINC00467 si-RNA on cell proliferation activity detected by CCK8 experiment

圖9qRT-PCR法檢測(cè)LINC00467si-RNA對(duì)細(xì)胞周期分子的影響

Fig.9 Effects ofLINC00467 si-RNA on CyclinD1 and CDK6 detected by qRT-PCR

圖10Westernblot法檢測(cè)LINC00467si-RNA對(duì)細(xì)胞周期分子的影響

Fig.10 Effects ofLINC00467 si-RNA on CyclinD1 and CDK6 detected by Western blot

3 討 論

NSCLC是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的肺部惡性腫瘤，具有極高的發(fā)病率和死亡率，居所有惡性腫瘤之首[13-14]。近來(lái)年，我國(guó)的NSCLC發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，其治療也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[15]。NSCLC的發(fā)病過(guò)程涉及多基因、多步驟、多階段，參與其中的基因及環(huán)境影響因素廣泛而復(fù)雜，因此NSCLC的確切發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在疾病的應(yīng)用逐漸深入，尋找合適、有效的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)是當(dāng)前NSCLC治療的新策略。

LncRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度在200～100 000 nt、缺少完整功能性的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)、僅編碼少量功能性短肽的RNAs分子[16-18]。LncRNAs的異常表達(dá)或功能缺失與多種疾病有關(guān)，如腫瘤、銀屑病、糖尿病、冠心病等[6-7]。LncRNA-LINC00467位于人類(lèi)染色體的lq32.3的位置，有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，全長(zhǎng)3 508 bp，屬于基因間的LncRNAs。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，LINC00467在多種腫瘤中處于紊亂表達(dá)狀態(tài)，武麗娜等[10]檢測(cè)67例結(jié)直腸癌患者組織中的LINC00467，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中LINC00467的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，但是LINC00467的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的分級(jí)、分期關(guān)系不大；類(lèi)似的，叢壯壯等[11]報(bào)道肺腺癌組織中LINC00467的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，盡管LINC00467的表達(dá)水平與肺腺癌的分期無(wú)關(guān)，但是與腫瘤大小和血管浸潤(rùn)有關(guān)。GEO是基于大量累積的基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)而形成的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，為疾病相關(guān)基因的分析提供了快捷、高效的途徑[19-20]。本研究分析GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)GSE19804和GSE18842數(shù)據(jù)集中LINC00467在NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)差異以及檢測(cè)25對(duì)NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的LINC00467表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LINC00467在GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)NSCLC組織中的表達(dá)高于正常肺組織(P<0.05)，且在NSCLC癌組織中LINC00467的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織的表達(dá)(P<0.05)；此外，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、NCI-H266、H1299中LINC00467的表達(dá)也高于肺正常上皮細(xì)胞系HBE(P<0.05)。這些結(jié)果表明，NSCLC患者的LINC00467表達(dá)升高，可能是判斷NSCLC發(fā)生的潛在標(biāo)志物。

腫瘤是一類(lèi)漸進(jìn)性增殖異常的疾病[21]，其發(fā)生發(fā)展常常伴隨著癌細(xì)胞的惡性增殖。研究顯示，NSCLC中LINC00467的高表達(dá)可能與其惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)，ATMADIBRATA等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子N-Myc可結(jié)合至LINC00467的啟動(dòng)子區(qū)從而抑制其轉(zhuǎn)錄，而LINC00467可通過(guò)減少抑癌蛋白DKK1的表達(dá)從而增強(qiáng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存活；此外，武麗娜等[10]報(bào)道LncRNA-LINC00467沉默后可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，而叢壯壯等[11]研究顯示，LncRNA-LINC00467沉默后可抑制HUVEC的血管生成能力。本研究通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、CCK8和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中通過(guò)siRNA沉默LINC00467的表達(dá)后細(xì)胞的增殖情況，與對(duì)照組si-NC細(xì)胞相比，流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)結(jié)果顯示si-LINC00467組處于G1期的細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)，處于S期的細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01)；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-LINC00467細(xì)胞組細(xì)胞克隆形成明顯受到了抑制，且克隆數(shù)量明顯減少(P<0.05)；CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-LINC00467細(xì)胞組的細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制(P<0.05)。這些結(jié)果表明，在NSCLC細(xì)胞中沉默LINC00467的表達(dá)可明顯抑制其惡性增殖的生物學(xué)表型。

細(xì)胞周期蛋白通常包括G1期、S期和M期蛋白3種，G1/S期轉(zhuǎn)化過(guò)程中的重要事件之一是CyclinD1與CDK6特異性結(jié)合，形成Cyclin D1-CDK6復(fù)合體，推進(jìn)G1期向S期的進(jìn)程[22-23]。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖常與細(xì)胞周期蛋白紊亂有關(guān)，尤其是G1期向S期轉(zhuǎn)化過(guò)程中的蛋白異常表達(dá)。本研究通過(guò)qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組si-NC細(xì)胞相比，si-LINC00467細(xì)胞組中CyclinD1和CDK6的表達(dá)水平均受到了不同程度的抑制(P<0.05)。同時(shí)，我們?cè)贚ncRNAs核質(zhì)定位實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LINC00467主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。上述結(jié)果顯示，LINC00467可在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)調(diào)控周期相關(guān)蛋白的表達(dá)從而影響周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)了NSCLC的增殖。本研究通過(guò)NSCLC臨床樣本的檢測(cè)、細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)和分子技術(shù)檢測(cè)等研究策略從LncRNA-LINC00467在NSCLC中的表達(dá)、定位及分子調(diào)控方式，并在體外水平探究了siRNA沉默LINC00467的表達(dá)水平后對(duì)NSCLC生物學(xué)行為的影響，這為后續(xù)深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，并且為L(zhǎng)INC00467在NSCLC的治療提供新的策略。

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