不同分期潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜血清素再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)分析

秦 燕，王進(jìn)海，徐艷麗，劉 娟，李新紅，劉素蓉

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所老年病科，陜西西安 710065)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)以排便習(xí)慣和大便性狀異常為主要癥狀，在潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)患者中較為常見(jiàn)，但其產(chǎn)生的原因尚未明確[1-2]。研究提示，胃腸運(yùn)動(dòng)功能紊亂、應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)臟反應(yīng)、腸道固有免疫及腸道微生物、基因多態(tài)性等因素均參與IBS的發(fā)病過(guò)程[3-5]。5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)為單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，由色氨酸羥化酶-1(tryptophan hydroxylase-1, TPH-1)參與合成，在腸道系統(tǒng)廣泛表達(dá)，調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)功能。5-HT代謝異常與IBS發(fā)生密切相關(guān)，其受體也是IBS治療藥物的靶點(diǎn)[4]。

血清素再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體(serotonin reuptake transporter, SERT)可以通過(guò)重吸收5-HT調(diào)節(jié)其活性[6-7]。SERT基因啟動(dòng)子多態(tài)性可以影響轉(zhuǎn)運(yùn)體在結(jié)腸黏膜中表達(dá)，在IBS的致病過(guò)程中起到重要作用[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SERT基因在結(jié)腸炎模型中表達(dá)降低，另外炎性因子水平提高可以下調(diào)SERT基因的表達(dá)[9-11]。目前，關(guān)于SERT是否在不同疾病分期UC患者結(jié)腸黏膜中有所差異尚存在爭(zhēng)議，而緩解期UC患者結(jié)腸黏膜中SERT表達(dá)的相關(guān)研究更為罕見(jiàn)。

本研究選擇UC患者作為研究對(duì)象，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SERT基因在活動(dòng)期和緩解期UC患者結(jié)腸黏膜及動(dòng)物模型中的表達(dá)情況。并利用內(nèi)鏡窄帶成像術(shù)(narrow band imaging, NBI)檢查分類(lèi)緩解期黏膜，分析SERT表達(dá)與內(nèi)鏡檢查結(jié)果、炎癥因子及血管形成相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性，探討UC疾病中IBS樣癥狀發(fā)生的機(jī)制，為炎癥性腸病的診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑HE染色試劑盒、免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(武漢博士德)；DAB顯色試劑盒、DEPC、Trizol試劑(Sigma公司，美國(guó))；所有一抗、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司，美國(guó))；SYBR?Select Master Mix(Applied Biosystems，美國(guó))。其他試劑為實(shí)驗(yàn)室常備。

1.2研究對(duì)象與資料收集研究對(duì)象均系西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科及兵器工業(yè)衛(wèi)生研究所收治患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床病史、癥狀、體征以及內(nèi)鏡檢查結(jié)果診斷為UC(活動(dòng)期或者緩解期)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腸道疾?。虎诤喜⒛[瘤、感染等重大疾病或者其他系統(tǒng)影響研究結(jié)果的疾??；③具有內(nèi)窺鏡檢查或者活檢檢查禁忌證。收集研究對(duì)象門(mén)診及住院就診醫(yī)療記錄。本研究方案經(jīng)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，相關(guān)方案獲得患者和家屬知情同意。

自2011年至2015年間共有31名患者納入研究，其中男性17名，女性14名，平均年齡(47.2±5.3)歲。患者病變累及全結(jié)腸共16例，左半結(jié)腸9例，直腸6例。平均患病時(shí)間6.1年，平均腹瀉次數(shù)(2.11±0.21)次。9名患者按照羅馬Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)診斷為IBS(腹瀉型2名，便秘型1名，不定型6名)。根據(jù)臨床病史、體征結(jié)合內(nèi)鏡檢查結(jié)果，共有11名患者診斷為活動(dòng)期，20名患者診斷為緩解期。

1.3內(nèi)鏡檢查與標(biāo)本收集使用NBI檢查進(jìn)一步將緩解期黏膜分為常規(guī)血管型(R型)和非常規(guī)血管型(UR型)，由2名醫(yī)師獨(dú)立評(píng)估分型。R型定義為：NBI圖像顯示黏膜具有腺窩開(kāi)口，伴隨常規(guī)血管網(wǎng)環(huán)繞；UR型定義為：結(jié)腸黏膜圖像與R型表現(xiàn)差異較大。使用內(nèi)窺鏡活檢術(shù)取出活檢標(biāo)本，用于組織學(xué)評(píng)估及RNA檢測(cè)。每位患者采集至多3個(gè)樣本，對(duì)于全部黏膜處于緩解期患者，取出R型和UR型樣本，對(duì)于活動(dòng)期患者取出活動(dòng)期黏膜樣本?；顧z標(biāo)本部分快速冰凍，液氮保存，部分40 g/L多聚甲醛固定，用于組織學(xué)評(píng)估。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)將上述部分腸黏膜標(biāo)本于RNA貯存專(zhuān)用試管，抽提總RNA，測(cè)定RNA濃度，利用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA，選擇GAPDH mRNA作為內(nèi)參，計(jì)算各基因相對(duì)濃度。檢測(cè)結(jié)腸炎癥對(duì)黏膜SERT表達(dá)的影響。使用NCBI blast tool及Primer3進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

1.5HE染色進(jìn)行標(biāo)本組織學(xué)評(píng)估標(biāo)本置于40 g/L多聚甲醛固定3 d，逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm，行HE染色。按照炎性活動(dòng)評(píng)分(Matts)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：1級(jí)，基本正常；2級(jí)，黏膜或黏膜下層有單核或者多核粒細(xì)胞浸潤(rùn)；3級(jí)，結(jié)腸全層糜爛伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4級(jí)，黏膜糜爛、隱窩膿腫，伴有炎性細(xì)胞全層浸潤(rùn)；5級(jí)，潰瘍、出血、黏膜壞死伴有上述細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.6免疫組織化學(xué)染色石蠟包埋標(biāo)本切片后，脫蠟至水，按照SP法行免疫組織化學(xué)染色。利用血清封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，使用兔抗人SERT抗體以及TPH-1抗體孵育過(guò)夜,檢測(cè)SERT及TPH-1的表達(dá)。鏡下觀(guān)察細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物判定為陽(yáng)性。

1.7高通量PCR分析成血管通路基因表達(dá)利用RT2 Profile PCR分析系統(tǒng)檢測(cè)成血管通路相關(guān)的84個(gè)關(guān)鍵性基因，即疾病相關(guān)通路表達(dá)譜。同上述提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度，按照第1序列試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，PCR儀參數(shù)設(shè)定為95 ℃(10 min)，40個(gè)循環(huán)：變性95 ℃ 15 s-退火60 ℃ 1 min-延長(zhǎng)60 ℃ 1 min。根據(jù)與GAPDH mRNA測(cè)定值的比例，計(jì)算mRNA 的相對(duì)濃度。

1.8動(dòng)物模型的構(gòu)建及相關(guān)基因檢測(cè)采用右旋葡聚糖苷鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型。8周齡清潔級(jí)C57B/6J雄性小鼠共40只，體質(zhì)量20～25 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，相關(guān)實(shí)驗(yàn)按照西安交通大學(xué)動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：模型組20只，飲水中加入2.5% DSS，持續(xù)5 d；對(duì)照組20只，飲水中加入等濃度葡萄糖。造模后0、7、14、21、28、56、84 d 采集結(jié)腸標(biāo)本，檢測(cè)相關(guān)基因變化，部分標(biāo)本甲醛固定后石蠟包埋切片，行組織學(xué)評(píng)估。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用校正t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；使用Spearman秩和檢驗(yàn)分析指標(biāo)間相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1UC患者SERT的表達(dá)及其與IBS樣癥狀發(fā)生的相關(guān)性活動(dòng)期患者IBS發(fā)生率為36.4%(4/11)，緩解期患者IBS發(fā)生率為40.0%(5/20)。常規(guī)結(jié)腸鏡活檢共取出有效標(biāo)本39個(gè)，其中11例由活動(dòng)期黏膜取出，28例由緩解期黏膜取出。SERT免疫組化結(jié)果提示，緩解期結(jié)腸黏膜腸上皮細(xì)胞SERT表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，活動(dòng)期黏膜SERT陽(yáng)性程度較低(圖1)。RT-PCR結(jié)果提示，緩解期黏膜SERT基因相對(duì)濃度高于活動(dòng)期黏膜，經(jīng)校正t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Spearman秩和檢驗(yàn)分析結(jié)果提示，SERT基因的表達(dá)與IBS癥狀表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

圖1潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜組織SERT表達(dá)情況

Fig.1 Expression of SERT in ulcerative colonic mucosa

A：腸上皮細(xì)胞SERT表達(dá)(緩解期)；B：腸上皮細(xì)胞SERT表達(dá)(活動(dòng)期)。

2.2UC患者SERT的表達(dá)與結(jié)腸炎癥的相關(guān)性Matts組織分級(jí)，1級(jí)5例標(biāo)本，2級(jí)22例標(biāo)本，3級(jí)7例標(biāo)本，4級(jí)3例標(biāo)本，5級(jí)2例標(biāo)本。Matts組織分級(jí)結(jié)果與SERT mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.38，P<0.001)?；顒?dòng)期黏膜IL-8 mRNA相對(duì)量高于緩解期黏膜，經(jīng)校正t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2)。IL-8 mRNA相對(duì)量與SERT mRNA相對(duì)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.59，P=0.002)。

圖2潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜SERT和IL-8mRNA表達(dá)

Fig.2 Expressions of SERT and IL-8 mRNA in ulcerative colonic mucosa

A：SERT mRNA表達(dá)；B：IL-8 mRNA表達(dá)。

2.3UC患者結(jié)腸黏膜TPH-1表達(dá)及其與結(jié)腸炎癥的相關(guān)性免疫組化染色結(jié)果顯示，TPH-1主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，在活動(dòng)期黏膜和緩解期黏膜組織中均有表達(dá)。活動(dòng)期黏膜TPH-1 mRNA相對(duì)量與緩解期黏膜相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.420)。TPH-1 mRNA的表達(dá)與黏膜IL-8 mRNA表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.28，P=0.100，圖3)。

圖3潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜TPH-1表達(dá)

Fig.3 Expression of TPH-1 in ulcerative colonic mucosa

A：腸上皮細(xì)胞TPH-1表達(dá)(緩解期)；B：腸上皮細(xì)胞TPH-1表達(dá)(活動(dòng)期)；C：TPH-1 mRNA表達(dá)。

2.4R型和UR型緩解期黏膜中SERT、TPH-1的表達(dá)緩解期R型黏膜大體表現(xiàn)與正常黏膜較為一致,兩種黏膜組織Matts組織學(xué)分級(jí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.172)。R型黏膜SERT基因mRNA的表達(dá)相對(duì)量與UR型黏膜相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；兩組SERT基因表達(dá)水平與活動(dòng)期黏膜SERT基因表達(dá)相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1<0.001，P2<0.001)。R型黏膜TPH-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與UR型黏膜相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.840，圖4)。

圖4常規(guī)血管型和非常規(guī)血管型緩解期黏膜NBI成像及SERT表達(dá)

Fig.4 NBI images and expression of SERT genes in colonic mucosa of irregular pattern and regular vessel pattern

A：R型黏膜NBI成像；B：UR型黏膜NBI成像；C：組織學(xué)評(píng)分對(duì)比；D：SERT mRNA表達(dá)；E：TPH-1 mRNA表達(dá)。

2.5R型和UR型緩解期黏膜中炎癥/成血管通路基因的表達(dá)高通量PCR分析結(jié)果提示，在84個(gè)基因中，10個(gè)基因在UR型黏膜組織中增高(圖5)，其中IL-1β、IL-8、CXCL3、CXCL5、CXCL1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著增高。上述基因在不同分期不同分型黏膜中表達(dá)如圖6所示。與3種黏膜SERT表達(dá)水平做相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6小鼠結(jié)腸炎模型SERT和MIP-2的表達(dá)造模后84 d時(shí)，DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1.54±0.53，對(duì)照組為0.03±0.01，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)，提示模型構(gòu)建成功。模型組SERT基因mRNA的表達(dá)相對(duì)濃度比為0.81±0.04，對(duì)照組為1.80±0.30，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。對(duì)比模型組SERT基因表達(dá)水平，在造模后84 d內(nèi)持續(xù)降低，MIP-2表達(dá)在造模過(guò)程中持續(xù)升高，停用DSS后下降。

圖5常規(guī)血管型和非常規(guī)血管型緩解期黏膜中炎癥/成血管通路基因的表達(dá)

Fig.5 Expression of inflammation- and angiogenesis-related genes in colonic mucosa of irregular pattern and regular vessel pattern

圖65種炎癥/成血管通路基因在不同分期分型黏膜中的相對(duì)表達(dá)

Fig.6 Expressions of five kinds of inflammation- and angiogenesis-related genes in colonic mucosa of different stages and types

表15種炎癥/成血管通路基因與SERT表達(dá)的相關(guān)性分析

Tab.1 Correlation of five kinds of inflammation- and angiogenesis-related genes and the expression of SERT mRNA

基因相關(guān)系數(shù)PIL?1β0．5190．001IL?80．631<0．001CXCL30．6580．001CXCL50．970<0．001CXCL10．923<0．001

3 討 論

本研究結(jié)果提示，在活動(dòng)期UC患者其結(jié)腸黏膜組織SERT基因表達(dá)下調(diào)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。SERT基因在緩解期UC患者結(jié)腸黏膜中表達(dá)與局部炎癥因子表達(dá)具有相關(guān)性，由于局部低程度的炎癥持續(xù)存在，可能導(dǎo)致SERT基因表達(dá)下調(diào)未恢復(fù)至正常。

SERT是5-HT的再攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要調(diào)節(jié)黏膜中5-HT的濃度，SERT基因水平下調(diào)，導(dǎo)致5-HT水平升高，影響胃腸正常運(yùn)動(dòng)功能，導(dǎo)致腸胃運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)或者障礙。既往研究多提示異常的SERT基因水平與IBS的發(fā)生密切相關(guān)。腹瀉型IBS患者血小板中SERT表達(dá)量明顯減少。SERT mRNA與十二指腸炎癥活動(dòng)具有負(fù)相關(guān)性，SERT表達(dá)水平下降還可能影響上消化道系統(tǒng)功能[12]。SERT基因啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)序列存在44對(duì)基本的缺失或者突變，可以形成S/L型等位基因。SS和SL型基因型與SERT mRNA的低水平轉(zhuǎn)錄具有相關(guān)性，是腹瀉型IBS的危險(xiǎn)因素[13]。還有研究指出，SERT啟動(dòng)子區(qū)域多態(tài)性與腹瀉型IBS發(fā)生無(wú)相關(guān)性[14]。因此，SERT基因多態(tài)性是否是SERT水平影響胃腸功能的具體機(jī)制，這一觀(guān)點(diǎn)還存在較多爭(zhēng)議。本研究未做相關(guān)多態(tài)性研究。

UC中SERT表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道不多。COATES等[15]發(fā)現(xiàn)UC患者結(jié)腸上皮細(xì)胞SERT mRNA的含量與免疫反應(yīng)程度具有負(fù)相關(guān)性；LACKNER等[16]利用UC和克羅恩病患者活檢組織，檢測(cè)SERT mRNA，結(jié)果提示克羅恩病患者活檢組織SERT表達(dá)量較高。有研究報(bào)道了SERT在UC緩解期黏膜中的表達(dá)水平與炎癥的關(guān)系[17]，文中分型與SERT表達(dá)結(jié)果與本研究類(lèi)似，但是該研究中未比較活動(dòng)期黏膜與不同分型黏膜的SERT水平差異。本研究結(jié)果提示，在活動(dòng)期UC結(jié)腸黏膜組織中SERT的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于緩解期不同分型結(jié)腸黏膜，SERT表達(dá)水平與IL-8炎性因子表達(dá)具有顯著相關(guān)。本研究嚴(yán)格篩選研究對(duì)象，入選對(duì)象經(jīng)臨床病史、癥狀以及內(nèi)鏡檢查確診，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SERT mRNA的表達(dá)情況，結(jié)論較為可靠。另外，上述相關(guān)研究中未分析IBS臨床癥狀與SERT相關(guān)性，本研究結(jié)論提示UC患者IBS樣癥狀與SERT基因表達(dá)具有顯著相關(guān)性。

組織病理學(xué)評(píng)估以及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也支持上述結(jié)論。在結(jié)腸炎動(dòng)物模型中SERT在腸上皮細(xì)胞表達(dá)，模型組炎性蛋白MIP-2表達(dá)增加，在停止DSS干預(yù)后，MIP-2水平回落，但是該組SERT表達(dá)持續(xù)呈低水平表達(dá)。在使用細(xì)菌制劑或者TNBS等誘導(dǎo)的腸炎中可以觀(guān)察到類(lèi)似結(jié)果[18]。

本研究檢測(cè)了TPH-1 mRNA的相對(duì)水平，結(jié)果顯示TPH-1表達(dá)在不同疾病分期標(biāo)本中無(wú)顯著差異，與炎性因子表達(dá)無(wú)關(guān)。TPH-1是參與5-HT合成的重要物質(zhì)，該結(jié)果顯示5-HT水平改變導(dǎo)致的胃腸功能紊亂可能與TPH-1無(wú)關(guān)，側(cè)面反映了SERT在上述病理過(guò)程的重要作用。

本研究通過(guò)NBI成像技術(shù)，將緩解期結(jié)腸黏膜分為R型和UR型，結(jié)果顯示SERT表達(dá)在UC患者緩解期黏膜中表達(dá)受到抑制，在UR型的緩解期黏膜中下降明顯。高通量PCR分析結(jié)果顯示，在UR型的緩解期黏膜中很多炎癥及血管相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，提示UR型黏膜存在低程度的炎性活動(dòng)。上述結(jié)果提示，SERT在UR型黏膜中表達(dá)下降與低程度的炎癥活動(dòng)存余有關(guān)。

近年來(lái)，有研究報(bào)道胃腸道免疫激活可能參與IBS的發(fā)生[19]。研究提示低程度的腸道炎癥以漿細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為表現(xiàn)，以前炎性因子的表達(dá)增加以及上皮細(xì)胞增生為特征。LAM等[20]檢測(cè)IBS患者十二指腸部位活檢標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)，組織上皮間隙淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞增多，SERT基因表達(dá)下調(diào)。SERT基因在IBS發(fā)病過(guò)程的重要作用已有較多文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)上述檢查發(fā)現(xiàn)的SERT基因在炎癥性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜的表達(dá)程度及規(guī)律，一方面為UC患者IBS樣癥狀形成的病理機(jī)制提供一定基礎(chǔ)；另一方面也揭示炎癥過(guò)程與SERT基因表達(dá)的關(guān)系，為IBS疾病研究提供證據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SERT在潰瘍性患者活動(dòng)期黏膜中表達(dá)下調(diào)，局部黏膜存在低程度炎癥時(shí)，緩解期黏膜中SERT表達(dá)水平仍然下調(diào)。提示SERT參與 UC患者IBS樣癥狀形成的病理過(guò)程。

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