PPAR-γ通過活化PTEN抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2的活化

盧家美，劉 丹，張?zhí)K梅，楊艷艷，呂治安，韓 錦，付榮國

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，陜西西安 710004；2. 西安醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，陜西西安 710021)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)是各種腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的共同途徑和主要病理學(xué)改變[1-2]，其發(fā)病機(jī)制為各種細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的腎成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的異常沉積。而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)的失衡被認(rèn)為是上述病理改變的主要分子機(jī)制[3]。其中，MMP家族的異?；罨蛔C實(shí)在上述病理生理過程中起關(guān)鍵作用。MMP2作為MMP家族主要成員，其異?；罨谀I間質(zhì)纖維化中發(fā)揮尤其重要的作用。MMP2作為一種降解膠原的主要蛋白水解酶，主要由腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞以水溶性酶原的形式分泌至細(xì)胞外，其在蛋白裂解酶的作用下，通過脫去部分前肽轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘男问?，從而發(fā)揮其相應(yīng)的分子生物學(xué)作用[4]。因此，探索腎成纖維細(xì)胞MMP2活化的分子機(jī)制并尋求有效的治療靶點(diǎn)對(duì)預(yù)防及治療腎間質(zhì)纖維化有著十分重要的意義。

血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一種重要的促細(xì)胞分裂劑，可刺激多種細(xì)胞的分裂與增殖，廣泛參與多個(gè)組織器官的生理活動(dòng)和病理損傷過程[5]。其過度表達(dá)在腎間質(zhì)纖維化中的作用日益受到重視。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PDGF主要通過誘導(dǎo)腎成纖維細(xì)胞活化增殖及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[6]。但是，PDGF通過何種信號(hào)機(jī)制及分子介質(zhì)發(fā)揮上述分子生物學(xué)作用目前尚不完全明確。MMP2作為腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵分子介質(zhì)，被證實(shí)廣泛參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病。研究還發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(P13K/AKT)介導(dǎo)了PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[7]。本研究將探討PDGF是否通過激活P13K/AKT信號(hào)通路活化MMP2從而誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators activated receptor-γ, PPAR-γ)作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于Ⅱ型核受體超家族成員。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮通過激活PPAR-γ廣泛抑制多種細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡及分化[8]。研究還發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ激動(dòng)劑通過活化人磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)特異性阻抑AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖[9-10]。本研究將探討激活的PPAR-γ是否通過活化PTEN抑制PI3K/AKT信號(hào)通路降低MMP2活性，進(jìn)而抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1原代腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的分離及培養(yǎng)取4～6周齡雌性Balb/c小鼠，頸椎脫臼法處死。采用FREDRIKSSON等[11]方法獲取小鼠原代腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞。無菌條件下分離并獲取腎髓質(zhì)，將腎髓質(zhì)剪成細(xì)小的組織塊，置于含0.5 mg/mL彈性蛋白酶(Sigma)、1.5 mg/mL膠原酶(Sigma)的溶液中培養(yǎng)30 min，離心收集細(xì)胞并培養(yǎng)于含150 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。以1.25 g/L胰酶消化細(xì)胞并傳代。所培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的波形蛋白(Sigma)染色，證實(shí)成纖維細(xì)胞陽性率大于95%。下述所有實(shí)驗(yàn)均在4～8代細(xì)胞中進(jìn)行，干預(yù)前均預(yù)先給予10 mL/L胎牛血清饑餓12 h。以PDGF-AA(Sigma)刺激原代培養(yǎng)的腎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)其增殖，LY294002(Sigma)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，GW9662(Sigma)、bpV(Pic；Sigma)分別抑制PPAR-γ、PTEN活性，羅格列酮購自Alexis公司。

1.2明膠酶譜檢測(cè)MMPs活性將含等量總蛋白的培養(yǎng)基上清上樣于含10 g/L明膠的膠中，以90、120 V恒壓電泳，切取包含72、92 ku大小的凝膠。置于洗脫液中震蕩洗脫2次(20 min/次)，漂洗液震蕩漂洗2次(20 min/次)。將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育48 h；考馬斯亮藍(lán)染色2 h，依次脫色后1.75 mol/L醋酸顯色。

1.3免疫印跡法檢測(cè)蛋白水平以RIPA裂解液(Bioteke Corporation)破碎原代培養(yǎng)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集裂解液上清以獲取細(xì)胞總蛋白。以BCA試劑盒(Pierce)檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度，等量上樣于100 g/L SDS-PAGE膠，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC；Bio-Rad)，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。以抗-p-AKT(Cell signal technology)、t-AKT(Cell signal technology)、TIMP1/TIMP2/TIMP3(Cell signal technology)、PPAR-γ(Cell signal technology)和GAPDH(Sigma)的兔源性抗體作為一抗，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(Sigma)作為二抗，West Pico化學(xué)熒光底物(Pierce)激發(fā)熒光并曝光于感光膠片，采用Scion NIH圖像分析軟件檢測(cè)免疫印跡強(qiáng)度，以檢測(cè)細(xì)胞中上述蛋白的表達(dá)水平。

1.4PTEN活性檢測(cè)采用PTEN 活性檢測(cè)ELISA試劑盒檢測(cè)PTEN的活性(Echelon biosciences Inc)，操作方法按照說明書進(jìn)行。獲取細(xì)胞裂解液上清，每孔100 μL等量上樣，37 ℃孵育2 h，TBST洗板3次，每次20 min，于450 nm波段下讀取A450值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性和方差齊性。采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較，Tukey post hoc檢驗(yàn)進(jìn)行組間的多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PDGF對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMPs/TIMPs活性的刺激作用基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的失衡被證實(shí)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常沉積乃至腎間質(zhì)纖維化的重要發(fā)病基礎(chǔ)，為明確PDGF通過上述何種分子介質(zhì)發(fā)揮誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化的作用，采用不同濃度的PDGF-AA(1、3、10、30 ng/mL)刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞24 h，對(duì)照組以與其他組等體積的PDGF-AA溶媒DMSO刺激細(xì)胞。采用明膠酶譜法檢測(cè)MMP2、MMP9的活性。結(jié)果顯示PDGF-AA劑量依賴性活化MMP2，峰濃度為10 ng/mL，而對(duì)MMP9無此作用(圖1A)。提取細(xì)胞裂解液，采用免疫印跡法檢測(cè)TIMP1、TIMP2、TIMP3水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGF-AA僅引起TIMP1的輕度升高，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.179，P>0.05，與對(duì)照組相比)，而對(duì)TIMP2、TIMP3的表達(dá)沒有影響(圖1B)。

圖1PDGF對(duì)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMPs/TIMPs活性的作用

Fig.1 Effects of PDGF on MMPs/TIMPs activation or production in mouse renal interstitial fibroblasts (n=3 in each group)

與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2AKT介導(dǎo)PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化為探討PDGF誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化的分子機(jī)制，10 ng/mL PDGF-AA刺激細(xì)胞30 min，采用免疫印跡法檢測(cè)p-AKT的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGF-AA顯著誘導(dǎo)AKT的磷酸化活化(P=0.000 1，P<0.01，與對(duì)照組相比；圖2A)。為進(jìn)一步明確激活的PI3K/AKT信號(hào)通路是否特異性介導(dǎo)了MMP2的活化，于PDGF-AA刺激細(xì)胞前1 h，預(yù)先予以PI3K抑制劑LY294002(50 μmol/L)孵育細(xì)胞，PDGF-AA干預(yù)細(xì)胞后24 h，檢測(cè)MMP2活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路顯著抑制PDGF-AA誘導(dǎo)的MMP2活化(P=0.002 3，P<0.01，與PDGF組相比；圖2B)。

2.3PPAR-γ抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化激活的PPAR-γ被證實(shí)顯著抑制慢性腎臟病動(dòng)物模型腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生，然而其分子機(jī)制尚不明確[9]。本研究旨在探討PPAR-γ是否通過抑制PDGF誘導(dǎo)的MMP2活化抑制腎間質(zhì)纖維化。首先，采用PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮(10 μmol/L)刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)羅格列酮可顯著激活PPAR-γ(P=0.004 2，P<0.01，與對(duì)照組相比；圖3A)。預(yù)先予以PPAR-γ抑制劑GW9662(10 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞，可顯著逆轉(zhuǎn)羅格列酮對(duì)PPAR-γ的激活(P=0.001 2,P<0.01，與羅格列酮組相比；圖3A)。進(jìn)一步，于PDGF-AA刺激腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞前1 h，采用PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮(10 μmol/L)刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)激活的PPAR-γ顯著抑制PDGF-AA誘導(dǎo)的MMP2活化(P=0.000 1,P<0.01，與PDGF組相比；圖3B)。采用GW9662特異性阻抑PPAR-γ的活性，可顯著逆轉(zhuǎn)羅格列酮對(duì)MMP2活性的抑制作用(P=0.000 1,P<0.01，與PDGF+Rosi組相比；圖3B)。

圖2AKT介導(dǎo)PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化

Fig.2 AKT mediated PDGF-induced MMP2 activation in mouse renal interstitial fibroblasts (n=3 in each group)

與對(duì)照組相比，**P<0.01；與PDGF組相比，# #P<0.01(LY29：LY294002)。

圖3PPAR-γ抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化

Fig.3 Rosiglitazone (Rosi) inhibited PDGF-stimuated MMP2 activation in renal interstitial fibroblasts (n=3 in each group)

與對(duì)照組相比，**P<0.01；與PDGF組相比，##P<0.01；與Rosi PDGF組相比，△△P<0.01(Rosi：羅格列酮組)。

2.4PPAR-γ通過激活PTEN抑制AKT磷酸化以抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化為進(jìn)一步明確激活的PPAR-γ抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化的分子機(jī)制，分別于PDGF-AA刺激細(xì)胞前1 h予以10 μmol/L的羅格列酮預(yù)處理細(xì)胞，PDGF-AA干預(yù)后半小時(shí)提取細(xì)胞裂解液上清，采用PTEN活性ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定PTEN活性。發(fā)現(xiàn)激活的PPAR-γ顯著活化PTEN(P=0.000 0，P<0.01，與PDGF組相比；圖4A)，而特異性阻抑PPAR-γ活性后，PTEN的活性顯著降低(P=0.001 5，P<0.01，與Rosi PDGF組相比；圖4A)，而PDGF-AA對(duì)PTEN的活性沒有影響(P=0.467 1，P>0.05，與對(duì)照組相比；圖4A)。進(jìn)一步，于PDGF-AA刺激細(xì)胞前1 h予以羅格列酮或同時(shí)予以羅格列酮+10 μmol/L PTEN抑制劑bpV(pic; Cayman, Ann Arbor)刺激細(xì)胞，以明確激活的PPAR-γ是否通過活化PTEN抑制AKT磷酸化發(fā)揮抑制MMP2的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制PTEN可逆轉(zhuǎn)PPAR-γ激活對(duì)AKT磷酸化、MMP2活化的抑制作用(P=0.003 9，P<0.01，與Rosi PDGF組相比；圖4B、4C)。提示PPAR-γ通過激活PTEN抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞AKT磷酸化進(jìn)而抑制MMP2活化。

圖4PPAR-γ通過激活PTEN抑制AKT磷酸化以抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化

Fig.4 PPAR-γ suppressed PDGF-induced MMP2 generation by activation of PTEN and resultant inhibition of AKT phosphorylation (n=3 in each group)

與對(duì)照組相比，**P<0.01；與PDGF組相比，##P<0.01；與PDGF+Rosi組相比，△△P<0.01(Rosi：羅格列酮；LY29：LY294002；Pic：PTEN抑制劑)。

3 討 論

本研究揭示PDGF通過激活腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路活化MMP2。而PDGF的上述作用可被激活的PPAR-γ抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ的上述作用通過激活PTEN實(shí)現(xiàn)[12]。本研究提示，激活PPAR-γ有望成為慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化的新的治療靶點(diǎn)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的平衡被證實(shí)在維持細(xì)胞外基質(zhì)生成及降解過程中發(fā)揮重要作用[13]。在慢性腎臟病患者及動(dòng)物模型中均證實(shí)MMPs/TIMPs失衡廣泛參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病[14]。而在MMP的眾多亞型中，MMP2被證實(shí)與腎臟重塑的關(guān)系最為密切。MMP2通過降解非纖維結(jié)構(gòu)樣膠原并裂解彈性蛋白以釋放具有生物活性的ECM碎片，其破壞彈性蛋白間的致密結(jié)構(gòu)，使腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞遷移至上皮下，并在一系列刺激因子的作用下，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞被活化、增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，從而啟動(dòng)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[14-17]。

PDGF作為成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等多種間充質(zhì)細(xì)胞的促有絲分裂原及集落刺激因子，被證實(shí)除刺激細(xì)胞增殖外，還具有誘導(dǎo)上述細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用[6]。而PDGF的上述作用是其在腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中發(fā)揮重要作用的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，針對(duì)PDGF引起的發(fā)病機(jī)制的治療，將成為慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化治療的重要靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF劑量依賴性活化MMP2，而MMP9等其他亞型在腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中活性較低[18-19]。PDGF對(duì)TIMP的表達(dá)的影響亦不明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PDGF誘導(dǎo)MMP2活化的作用是通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究提示PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的MMPs/TIMPs失衡與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。

圖5PPAR-γ抑制PDGF誘導(dǎo)的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞MMP2活化的分子機(jī)制

Fig.5 Proposed mechanisms of the inhibition of PPAR-γ on PDGF-induced MMP2 activation in renal interstitial fibroblasts

PPAR-γ作為重要的內(nèi)源性核轉(zhuǎn)錄因子，被證實(shí)可通過抑制腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積抑制慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[9,20]。研究發(fā)現(xiàn)，MMP2介導(dǎo)了慢性腎臟病動(dòng)物模型腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生[14,21]。然而，激活的PPAR-γ是否通過抑制MMP2活化發(fā)揮上述作用目前尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，激活的PPAR-γ顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的MMP2活化；而PPAR-γ的上述作用是通過激活PTEN從而抑制AKT磷酸化實(shí)現(xiàn)的。PTEN作為一種重要的抑癌基因，還發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及能量代謝的作用，而PTEN的上述分子生物學(xué)作用主要通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)(圖5)。

目前，多種PPAR-γ激動(dòng)劑已經(jīng)廣泛用于臨床治療糖尿病，一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)激活的PPAR-γ對(duì)腫瘤、肺間質(zhì)纖維化、慢性支氣管炎、冠心病等具有顯著的保護(hù)作用[22]。本研究結(jié)果提示，激活的PPAR-γ具有潛在抑制腎間質(zhì)纖維化的作用，為慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化的治療提供了新的治療方法。然而，PPAR-γ激動(dòng)劑能否用于慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化的治療，尚需一系列的研究以證實(shí)其安全性及有效性。

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