miR-126修飾的間質(zhì)干細胞來源的外泌體對大鼠早期缺血性股骨頭壞死的影響

周山健，李海樂，肖大偉，田大川，劉丹平

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，遼寧錦州 121001；2. 漯河市中心醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，河南漯河 462000)

股骨頭壞死是長期或大劑量使用類固醇皮質(zhì)激素治療諸多疾病后的嚴重并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制可能是類固醇皮質(zhì)激素導(dǎo)致股骨頭區(qū)血管內(nèi)血栓形成和血管外髓內(nèi)脂質(zhì)沉積，并最終造成血供的破壞，進而誘發(fā)局部缺血和骨細胞死亡，并演進為軟骨下骨的崩解[1-2]。目前，軟骨下骨損壞后的唯一有效治療方法為髖關(guān)節(jié)置換，但對于年輕患者而言，其植入假體的耐久性調(diào)查結(jié)果并不樂觀[3]。因此，針對軟骨下骨崩解前的干預(yù)性治療顯得尤為重要。近年來，干細胞移植療法在促進血管再生方面顯示出巨大的應(yīng)用前景，但潛在的免疫排斥和染色體變異特性限制了其在臨床中的發(fā)展[4-5]。最新研究發(fā)現(xiàn)，源于干細胞的外泌體包含多種蛋白質(zhì)、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)及微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid, miRNA)等，在促進血管生成方面有一定效果，且不會出現(xiàn)排斥反應(yīng)和染色體變異[6]。然而，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體(MSC-Exos)中促血管成分含量較少。全基因組和基因分析結(jié)果顯示，微小核糖核酸-126(miR-126)在血管再生方面效果顯著[7]。因此，可利用miR-126質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs，獲得miR-126高含量的MSC-126-Exos。目前，尚未見相關(guān)文獻報道利用MSC-126-Exos治療大鼠SANFH。本研究擬通過觀察MSC-126-Exos對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖、遷移和成管以及成血管相關(guān)基因表達的影響，以及在體實驗觀察股骨頭壞死區(qū)的血管新生和骨密度，評估MSC-126-Exos對大鼠SANFH的治療作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物6周齡雄性SD大鼠由錦州醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心提供，按照光照和黑暗每12 h 交替的環(huán)境中標準飼養(yǎng)，用于MSCs分離培養(yǎng)、SANFH動物模型建立及外泌體注射治療。所有實驗大鼠符合衛(wèi)生部一級動物標準，并通過動物倫理學(xué)委員會批準。

1.2主要試劑及儀器胎牛血清(FBS)和Opti-MEM、L-DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco美國)，F(xiàn)icoll液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，micrONTMmiRNA mimic(廣州市銳博生物科技有限公司)，mirVana miRNA 分離試劑盒(Ambion美國)，miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒和miScript SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN德國)，MTT和DiL(Sigma美國)，BCA蛋白定量試劑盒和ECL顯影液(上海碧云天生物技術(shù)公司)，Matrigel基質(zhì)膠(BD美國)，甲潑尼龍(MPS， Pfizer美國)，脂多糖、小鼠抗大鼠CD9、CD63、CD81抗體和HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(Absci美國)，DAPI、小鼠抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)抗體、小鼠抗β-actin抗體、兔抗大鼠-CD31抗體和Alexa-Fluor 647-結(jié)合羊抗兔抗體(Abcam英國)。Hitachi H-7650透射電鏡和超高速離心機(HITACHI日本)，蛋白凝膠分離和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad美國)，蛋白發(fā)光顯影儀(OMEGA美國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus日本)，Micro-CT掃描儀(SCANCO Medical AG瑞士)。

1.3細胞培養(yǎng)參照文獻[7]方法提取大鼠原代MSCs，接種于含100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

HUVEC購自ATCC，實驗室傳代后使用，含100 mL/L FBS+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)基置于37 ℃、50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.4外泌體的提取及鑒定[8]用去除外泌體的L-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs 48 h后，將上清4 ℃ 7 400 r/min離心30 min去除細胞碎片后，再置入超離管以4 ℃、29 700 r/min離心2 h，PBS重懸提取外泌體并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進一步應(yīng)用Western blot法檢測外泌體特異性蛋白CD9(1)、CD63和CD81表達。用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)。取5 μL提取懸液于鎳碳合金網(wǎng)上靜置10 min后置于室溫風(fēng)干箱中風(fēng)干，取出后以草酸鈾負染液負染10 min，PBS反復(fù)洗膜5次，室溫干燥后電壓80 kV透射電鏡下觀察。

1.5HUVECs攝取外泌體將提取好的MSC-Exos用DiL標記。取對數(shù)生長期的HUVECs消化離心后接種于6孔板，待細胞生長融合至70%，將所獲DiL標記的MSC-Exos與HUVECs共孵育4 h[10]，PBS沖洗后，40 g/L多聚甲醛固定，DAPI染核，以倒置熒光顯微鏡觀察。

1.6miR-126的轉(zhuǎn)染及qRT-PCR檢測MSCs培養(yǎng)傳至第3代，取融合度50%左右細胞，用Opti-MEM、Lipofectamine 2000試劑將30 nmol/L micrONTMmiRNA mimic轉(zhuǎn)染至MSCs內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進行后續(xù)實驗。按照mirVana miRNA分離試劑盒操作步驟，分離所提純MSC-Exos和MSC-126-Exos中的miR-126，cDNA合成使用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒[9]。miR-126引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3′和5′-TGG-TGTCGTGGAGTCG-3′，使用miR-126引物和miScript SYBR Green PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測。將U6作為其內(nèi)參，其序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和5′-AACGCTTC-ACGAATTTGCGT-3′。miR-126的相對表達應(yīng)用2-ΔΔCT進行計算。

1.7體外實驗檢測MSC-126-Exos對HUVECs的影響分別以80 mg/L MSC-126-Exos、80 mg/L MSC-Exos以及含有相同體積 PBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基處理作為實驗組、對照組和空白組。

MTT實驗檢測HUVECs細胞增殖，使用酶標儀在490 nm波長下進行檢測獲取吸光度值。

細胞劃痕實驗用于檢測MSC-126-Exos對HUVECs遷移的影響，于倒置熒光顯微鏡下進行觀察劃痕變化，細胞遷移率=(0 h劃痕的平均邊距-24 h劃痕的平均邊距)/0 h劃痕的平均邊距×100%。

HUVECs的成管實驗[10]檢測MSC-126-Exos對HUVECs毛細血管網(wǎng)形成的影響，倒置顯微鏡下觀察成管情況，選取5個隨機視野中分支點的數(shù)目作為成管的效果指標。Western blot法檢測HUVECs中VEGFA的表達水平，所得結(jié)果采用Image-J進行分析。

1.8大鼠SANFH模型的建立及分組選取6周齡雄性SD大鼠18只，靜脈注射10 μg/kg脂多糖和肌肉注射20 mg/kg甲潑尼龍，構(gòu)建大鼠SANFH模型[11]。將其隨機分為3組：模型組(每周尾靜脈注射200 μL PBS)、MSC-Exos組(每周尾靜脈注射200 μg MSC-Exos)和MSC-126-Exos組(每周尾靜脈注射200 μg MSC-126-Exos)。注射后分籠飼養(yǎng)，并每天使其自由活動以運動髖關(guān)節(jié)。6周后，將所有SD大鼠麻醉后處死并取股骨頭以備檢測。

1.9免疫熒光分析股骨頭區(qū)血管密度各組大鼠單側(cè)股骨頭標本進行脫鈣、石蠟包埋并切片，常規(guī)操作進行抗原修復(fù)、50 mL/L山羊血清封閉后，一抗(CD31 1∶200)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次后，熒光二抗(1∶500)暗盒室溫孵育30 min，用DAPI染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察分析，隨機選取各組切片鏡下視野，血管新生通過CD31染色陽性的典型圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)的數(shù)目進行估量。

1.10Micro-CT掃描檢測股骨頭骨質(zhì)各組大鼠單側(cè)股骨頭標本取出后，進行中性甲醛(100 mL/L甲醛)固定過夜，次日PBS清洗后，置于Mircro-CT掃描儀進行檢測[11]。設(shè)定掃描儀的分辨率為每像素14.8 μm。骨小梁從骨髓中分離后，分析骨質(zhì)評估值：小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、小梁數(shù)(trabecular number, Tb.N)和每組織體積骨量(bone volume per tissue volume, BV/TV)，并在圖片查看器Evaluation中選取每個樣本的冠狀面和橫斷面作為骨修復(fù)的大體觀。

2 結(jié) 果

2.1MSCs外泌體的鑒定和HUVECs攝取情況分析應(yīng)用透射電鏡掃描提純的MSC-Exos，其形態(tài)大多為杯形或圓形結(jié)構(gòu)，且直徑在40～100 nm范圍之間(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示，MSC-Exos表達特異性的外泌體表面蛋白CD9、CD63和CD81(圖1C)。倒置熒光顯微鏡下觀察DiL標記的MSC-Exos被HUVECs攝取，且其主要集中在細胞核附近(圖1B)。

圖1MSCs外泌體(MSC-Exos)的鑒定和HUVECs攝取情況

Fig.1 Identification and analysis of MSC-Exos and uptake by HUVECs

A：透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)(×50 000)；B：HUVECs細胞攝取外泌體(×400)；C：Western blot檢測外泌體CD9、CD63和CD81蛋白的表達。

2.2MSCs外泌體中miR-126的相對含量外泌體中miR-126實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，MSC-126-Exos中的miR-126相對含量(0.85±0.03)顯著高于MSC-Exos組(0.25±0.05)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2實時熒光定量PCR檢測MSC-126-Exos和MSC-Exos中miR-126的相對含量

Fig.2 The relative content of miR-126 in MSC-126-Exos and MSC-Exos detected by RT-qPCR

2.3MSC-126-Exos促進HUVECs增殖、遷移和成管MTT結(jié)果顯示，實驗組HUVECs 24 h時的增殖率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。劃痕實驗結(jié)果顯示，實驗組HUVECs在24 h時的遷移度較對照組和空白組明顯(圖3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。應(yīng)用3D-Matrigel評估MSC-126-Exos對HUVECs成管的作用，結(jié)果顯示HUVECs在3組實驗中均能形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)，但在空白組生成的管樣結(jié)構(gòu)較少，4 h時實驗組較對照組成管的長度和分支數(shù)量多(圖4A～C)，且有明顯差異(P<0.05)，且顯著多于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。8 h時實驗組成管的數(shù)量也較對照組和空白組顯著增多(圖4D～F)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.4各組HUVECs中VEGFA的表達水平Western blot檢測結(jié)果顯示，MSC-126-Exos和MSC-Exos刺激HUVECs時，實驗組和對照組HUVECs中VEGFA的表達均較空白組顯著，且實驗組又顯著強于對照組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5，表1)。

圖3劃痕實驗評估MSC-126-Exos對HUEVCs遷移的促進作用

Fig.3 Promotion of MSC-126-Exos in cell migration of HUEVCs detected by scratch test (×40)

A、D：實驗組；B、E：對照組；C、F：空白組。

表1各組HUVECs在MTT實驗中的增殖率、劃痕實驗中的遷移率、在成管實驗中形成節(jié)點分支數(shù)目和VEGFA的表達水平

組別增殖率(%)遷移率(%)成管數(shù)量(n/field)4h8hVEGFA表達實驗組0．93±0．03?#85．08±4．05?#57．67±2．52?#88．00±5．57?#0．80±0．04?#對照組0．63±0．02?63．34±3．23?46．00±4．36?58．67±3．51?0．45±0．04?空白組0．42±0．0143．76±2．7715．00±2．0029．00±3．610．16±0．03

與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05。

圖4成管實驗評估MSC-126-Exos對HUEVCs成管的促進作用

Fig.4 Promotion of MSC-126-Exos in tube formation of HUEVCs detected by tubule formation assay (×100)

A、D：實驗組；B、E：對照組；C、F：空白組。

圖5Westernblot檢測各組HUVECs中VEFGA的表達

Fig.5 Expressions of VEGFA in HUVECs in various groups detected by Western blot

1：實驗組；2：對照組；3：空白組。

2.5各組股骨頭區(qū)的血管密度及小梁骨量變化間斷注射外泌體治療大鼠SANFH 6周后，通過股骨頭標本的CD31免疫熒光染色計數(shù)微血管密度觀察股骨頭區(qū)的新生血管。結(jié)果顯示，MSC-126-Exos組微血管呈近圓形滿視野分布(圖6A)；MSC-Exos組相對較少，且血管直徑也較大(圖6B)；模型組視野中出現(xiàn)極少血管(圖6C)。統(tǒng)計分析各組隨機視野中微血管密度，結(jié)果顯示，MSC-126-Exos組微血管密度顯著多于MSC-Exos組和模型組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖6各組大鼠股骨頭CD31標記的血管密度

Fig.6 The blood vessel density of the femoral head in rats in various groups (×100)

A：模型組；B：MSC-Exos組；C：MSC-126-Exos組。箭頭所指紅色熒光：CD31陽性結(jié)果。

MSC-126-Exos組和MSC-Exos組大鼠股骨頭的Micro-CT掃描結(jié)果顯示，冠狀面表現(xiàn)為股骨頭形態(tài)正常，股骨頭區(qū)骨密度影正常，且MSC-126-Exos組較MSC-Exos組更為致密(圖7B、C)；橫斷面表現(xiàn)為骨小梁排列規(guī)則而連續(xù)，且MSC-126-Exos組的小梁厚度及密度大于MSC-Exos組(圖7E、F)。模型組冠狀面表現(xiàn)為股骨頭形態(tài)尚可，但股骨頭近端出現(xiàn)沿頭緣透光區(qū)，內(nèi)呈軟組織密度，且靠近干骺端處骨小梁增粗硬化，并呈不規(guī)則排列(圖7A)；其橫斷面呈現(xiàn)骨小梁密度下降，形態(tài)扭曲，出現(xiàn)簇狀或條索狀分布且形態(tài)模糊(圖7D)。骨質(zhì)評估值分析結(jié)果表明：MSC-126-Exos組和MSC-Exos組顯著高于模型組，且MSC-126-Exos組又較MSC-Exos組顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

圖7各組大鼠股骨頭Micro-CT掃描成像

Fig.7 The Micro-CT scan imaging of the femoral head in rats in various groups

A、D：模型組；B、E：MSC-Exos組；C、F：MSC-126-Exos組。

表2各組大鼠股骨頭壞死區(qū)CD31標記的血管密度及骨質(zhì)評估值

組別血管密度(n/field)Tb．Th(mm)Tb．Sp(mm)Tb．N(n)BV/TV模型組7．33±2．52#0．07±0．00#0．44±0．04#2．37±0．13#0．23±0．02#MSC?Exos組15．32±1．53?0．09±0．00?0．23±0．04?5．64±0．13?0．64±0．03?MSC?126?Exos組27．33±2．52?#0．12±0．02?#0．11±0．01?#6．72±0．12?#0．73±0．03?#

與模型組比較，*P<0.05；與100 mg/L MSC-Exos組比較，#P<0.05。

3 討 論

激素性股骨頭壞死是由于長期或大量使用類固醇激素造成的嚴重疾病，發(fā)病率有逐漸增高的趨勢[12]。股骨頭發(fā)生壞死后，不僅骨的結(jié)構(gòu)遭到破壞，而且強度降低，導(dǎo)致較高的致殘率，如果在早期階段進行有效干預(yù)治療，將可能終止壞死的進程，避免進一步發(fā)展導(dǎo)致股骨頭塌陷。在股骨頭壞死的早期階段，小范圍的壞死組織可以溶解吸收，通過促進骨再生和再骨化，形成骨性愈合[13]。而骨性愈合的過程高度依賴于血管的再生，新生的血管可以為成骨過程提供充足的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)以及所需的微環(huán)境[14]。因此，盡量在股骨頭塌陷之前，通過改善骨壞死區(qū)的血供，促進骨修復(fù)和再生是針對早期股骨頭壞死干預(yù)治療的重點。

外泌體是細胞分泌的大小在40～100 nm之間的膜囊泡，通過負載多種具有生物活性的成分如miRNA等物質(zhì)在細胞與細胞間的溝通中發(fā)揮重要作用[15-16]。實際上，外泌體已經(jīng)被證實在促進皮膚損傷修復(fù)、急性肺損傷的保護以及肝纖維化的緩解等多種疾病模型中具有重要的治療作用[16-18]，大量報道顯示，干細胞分泌的外泌體在促進血管新生方面具有很強的優(yōu)勢，被認為是一種調(diào)節(jié)血管新生的介質(zhì)，如TENG等[19]證實，在心肌缺血性損傷中，MSCs分泌的外泌體能促進新生血管生成和抑制炎癥反應(yīng)而改善心功能。近年來，許多研究表明外泌體負載的miRNA可以通過調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖、遷移、凋亡影響血管生成[20-21]，在促進和調(diào)控血管生成的過程中起重要作用[22-23]。miR-126是其中重要的miRNA之一，位于表皮生長樣結(jié)構(gòu)域蛋白7(epidermal growth factor like protein 7, Egfl-7)基因的內(nèi)含子上，在內(nèi)皮細胞上特異性表達[23]。大量研究報道m(xù)iR-126與血管內(nèi)皮細胞及血管功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-126能夠激活VEGF依賴的信號通路，促進血管生成[24]。但是，MSC-Exos中促血管的miRNA含量有限，本研究利用構(gòu)建過表達miRNA-126的MSCs，獲得miR-126含量高的MSC-126-Exos。體外實驗結(jié)果顯示，實驗組HUVECs的增殖率、遷移速度及4 h和8 h成管能力分別為對照組的1.5倍、1.3倍、1.3倍和1.5倍，同時VEGFA的表達為對照組的1.8倍。以上結(jié)果表明MSC-126-Exos較MSC-Exos具有更強的促成血管功能；動物實驗也表明MSC-126-Exos對于股骨頭壞死區(qū)的血管修復(fù)作用較MSC-Exos組更顯著。

相關(guān)研究表明，骨壞死區(qū)域的血管生成對骨折修復(fù)有重要作用[25-26]，且壞死區(qū)的血供可以直接影響骨痂形成[27]。本研究中MSC-126-Exos組股骨頭Micro-CT掃描結(jié)果分析也顯示，MSC-126-Exos組的Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N和BV/TV值分別為MSC-Exos組的1.4倍、0.5倍、1.2倍和1.2倍，表明MSC-126-Exos在改善壞死股骨頭區(qū)骨質(zhì)方面的效果要強于MSC-Exos。因此，通過修飾MSCs使其外泌體中miRNA等含量或成分發(fā)生變化，充分發(fā)揮外泌體生物學(xué)作用，可為干細胞治療和進一步臨床應(yīng)用提供新的思路。

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