鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥分子特征的研究

韓 蕾，雷金娥，祁 杰，韓少山，徐紀(jì)茹

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，陜西西安 710061；2. 環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061；3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710061；4. 陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科，陜西西安 710068；5. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是引起院內(nèi)感染及暴發(fā)流行的一種重要條件致病菌[1]，可引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、創(chuàng)口、血流等多種組織器官的感染，尤以在ICU內(nèi)感染率較高[2]。該菌耐藥性顯著，除對部分抗生素天然耐藥外，還可通過多種途徑對不同抗生素產(chǎn)生獲得性耐藥，從而產(chǎn)生多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥菌株，增加治療的難度[3-4]。

碳青霉烯類抗生素對鮑曼不動(dòng)桿菌有較好的抗菌活性，是臨床上用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的重要藥物[5]。但是，近年來隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，鮑曼不動(dòng)桿菌對此類藥物的耐藥性顯著增加，出現(xiàn)了耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistantA.baumannii, CRAB)，其最主要的耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶[6-7]。本研究收集110株經(jīng)VITEK-2鑒定的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株，采用特異性PCR擴(kuò)增法確認(rèn)菌種后，檢測它們對亞胺培南和美羅培南的耐藥性，并分析細(xì)菌基因組中碳青霉烯酶基因的攜帶情況，研究鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的分子特征。

1 材料與方法

1.1細(xì)菌及培養(yǎng)條件自2013年2月至2014年12月，從西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院和第二附屬醫(yī)院收集經(jīng)VITEK-2鑒定的鮑曼不動(dòng)桿菌110株。用Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌，并進(jìn)行藥物敏感性檢測。

1.2DNA提取及PCR特異性引物鑒定使用細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根)對110株細(xì)菌進(jìn)行基因組DNA提取，操作步驟按說明書進(jìn)行。為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，使用特異性引物sp2F、sp4F和sp4R[8]通過PCR方法復(fù)檢菌株。采用Golden Easy PCR System(天根)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系遵照說明書。PCR循環(huán)體系：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并在成像分析儀中拍照分析。

1.3碳青霉烯類抗生素藥物敏感性檢測使用VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀檢測細(xì)菌對亞胺培南和美羅培南的藥物敏感性。

1.4碳青霉烯酶基因檢測檢測5種Ambler A類酶基因(blaKPC、blaGES、blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1,3,10-12,15)，6種Ambler B類酶基因(blaIMP-1,4,5,6,9,10,18、blaIMP-2,8,13,19,20、blaVIM-1,2,4,5、blaVIM-2,6,8-11、blaSIM-1、blaNDM-1)和4種Ambler D類酶基因(blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like)，引物同聶璐[9]報(bào)道。采用Golden Easy PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系遵照說明書。PCR循環(huán)體系：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測，并在成像分析儀中拍照分析。

2 結(jié) 果

2.1鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的鑒定結(jié)果使用引物sp2F、sp4F和sp4R，PCR擴(kuò)增后得到294 bp和490 bp兩個(gè)片段的菌株即為鮑曼不動(dòng)桿菌[8](圖1)。本研究中收集的110株經(jīng)VITEK-2初步鑒定的菌株中，96株最終確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌，VITEK-2檢測的準(zhǔn)確率為87.3%。

圖1特異性引物PCR鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌的結(jié)果示例

Fig.1 Examples ofA.baumanniiidentification using specific PCR

M：100 bp ladder；1～16，S1～S15：經(jīng)VITEK-2鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌的部分臨床菌株；-Ve：PCR陰性對照。

2.2碳青霉烯類抗生素藥敏的檢測結(jié)果經(jīng)VITEK-2全自動(dòng)微生物分析儀檢測發(fā)現(xiàn)，110株細(xì)菌的碳青霉烯類耐藥率為74.5%(82/110)，且這些耐藥菌株對亞胺培南和美羅培南均耐藥。96株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株中，有80株對亞胺培南和美羅培南耐藥(MIC≥32 μg/mL)，耐藥率達(dá)83.3%。14株非鮑曼不動(dòng)桿菌中，僅2株對亞胺培南和美羅培南耐藥，耐藥率為14.3%。

2.3鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因的檢測結(jié)果對96株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株進(jìn)行15種碳青霉烯酶基因的PCR檢測，共有3個(gè)基因檢測陽性，分別為blaTEM、blaOXA-23-like和blaOXA-51-like，陽性擴(kuò)增結(jié)果示例見圖2。3種耐藥基因的檢出率分別為77.1%(74/96)、83.3%(80/96)及100%(96/96)，其中blaTEM和blaOXA-23-like基因僅在碳青霉烯類抗生素耐藥(carbapenem resistant, CR)的菌株中檢出，而blaOXA-51-like基因既存在于CR菌株中，也存在于碳青霉烯類抗生素敏感(carbapenem susceptible, CS)菌株中(表1)。

圖2碳青霉烯酶基因陽性擴(kuò)增結(jié)果示例

Fig.2 Examples of positive amplifications of carbapenemase genes

A：blaTEM(1 079 bp)；B：blaOXA-23-like(1 067 bp)；C：blaOXA-51-like(825 bp)。M：100 bp ladder；1～5：鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株1～5。

表1碳青霉烯酶基因在96株鮑曼不動(dòng)桿菌中的分布

Tab.1 Distribution of carbapenemase genes in 96A.baumanniistrains

陽性耐藥基因耐藥表型耐藥基因陽性菌株菌株數(shù)(株)占本表型比率(%)blaTEMCR1～32、35～39、41～43、46～62、64～807492．5CS-00blaOXA?23?likeCR1～32、34～62、64～8280100．0CS-00blaOXA?51?likeCR1～32、34～62、64～8280100．0CSS1、S3、S5、S10～S12、S14～S17、S21～S23、S25～S2716100．0

2.4鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因模式耐藥基因檢測結(jié)果顯示，96株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株具有3種耐藥基因攜帶模式(表2)，并以多基因聯(lián)合耐藥模式為主。其中blaTEM+blaOXA-23-like+blaOXA-51-like三聯(lián)耐藥模式的檢出率最高，為79.2%。隨后為blaOXA-23-like+blaOXA-51-like，檢出率為4.2%。blaOXA-51-like的單基因模式僅出現(xiàn)在碳青霉烯類敏感菌株中。

表296株鮑曼不動(dòng)桿菌的碳青霉烯類耐藥基因模式

Tab.2 Carbapenem-resistant gene profile of 96A.baumanniistrains

耐藥基因模式耐藥表型菌株數(shù)(株)檢出率(%)blaTEM+blaOXA?23?like+blaOXA?51?likeCR7679．2blaOXA?23?like+blaOXA?51?likeCR44．2blaOXA?51?likeCS1616．7

2.5碳青霉烯類酶基因與CR耐藥表型相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)分析耐藥基因與耐藥表型的相關(guān)性，結(jié)果顯示blaTEM和blaOXA-23-like基因與鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥有相關(guān)性(均為P<0.01)，且blaOXA-23-like的相依系數(shù)(0.680)高于blaTEM(0.643)，說明前者與碳青霉烯類抗生素耐藥的相關(guān)性更高(表3)。而耐藥菌株和敏感菌株中均攜帶blaOXA-51-like基因，因此該基因與耐藥表型無明顯相關(guān)性。

表3碳青霉烯酶基因與耐藥表型的相關(guān)性分析

Tab.3 Correlation analysis between carbapenemase genes and CR phenotype

耐藥基因P相依系數(shù)blaTEM0．0010．643blaOXA?23?like0．0010．680blaOXA?51?like--

3 討 論

分子生物學(xué)方法通過對細(xì)菌特異性基因進(jìn)行序列分析或檢測，達(dá)到對菌種進(jìn)行鑒定的目的，具有準(zhǔn)確、高效、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[10]。其中特異性PCR擴(kuò)增法可快速鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌，將其同醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群中的其他種區(qū)分開，較臨床常規(guī)的VITEK-2檢測法準(zhǔn)確性高。

近年來，鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性持續(xù)增加，中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別從2005年的31.0%和39.0%上升至2014年的62.4%和66.7%[11]。本研究檢測的鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對碳青霉烯類抗生素的耐藥率高于全國平均水平，達(dá)到83.3%，且耐藥株對亞胺培南和美羅培南同時(shí)耐藥，這可能由于菌株主要分離自ICU所引起。此外，結(jié)合菌種鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率遠(yuǎn)高于非鮑曼不動(dòng)桿菌，提示鮑曼不動(dòng)桿菌較不動(dòng)桿菌屬的其他細(xì)菌更易產(chǎn)生耐藥性。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的鮑曼不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的機(jī)制有：①產(chǎn)碳青霉烯酶，水解碳青霉烯類抗生素；②膜孔蛋白缺失、突變導(dǎo)致膜通透性降低；③青霉素結(jié)合蛋白改變導(dǎo)致與抗生素親和力降低；④主動(dòng)外排泵將藥物排出菌體外等[6-7,12]，其中研究最廣泛的是產(chǎn)碳青霉烯酶。本研究從96株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株中，主要檢測到blaTEM、blaOXA-23-like及blaOXA-51-like三種碳青霉烯酶基因，其中耐藥菌株和敏感菌株均攜帶blaOXA-51-like基因，而blaTEM和blaOXA-23-like僅存在于耐藥菌株中，檢出率分別為92.5%和100.0%。因此，耐藥基因攜帶模式表現(xiàn)為3種：blaTEM+blaOXA-23-like+blaOXA-51-like三聯(lián)模式、blaOXA-23-like+blaOXA-51-like二聯(lián)模式和blaOXA-51-like的單基因模式，并以多基因聯(lián)合耐藥模式為主，與前人研究結(jié)果相符[9]。blaOXA-23-like屬于Ambler D類酶基因，是CRAB中最常檢出的碳青霉烯酶基因，與碳青霉烯類抗生素耐藥密切相關(guān)[13]。blaTEM為Ambler A類酶基因，常與blaOXA-23-like伴隨存在，在本研究中與碳青霉烯類抗生素耐藥的相關(guān)性僅次于blaOXA-23-like。

由廣泛使用碳青霉烯類抗生素造成的鮑曼不動(dòng)桿菌對其耐藥已成為臨床治療感染的棘手難題。本研究在鮑曼不動(dòng)桿菌中檢測出blaOXA-23-like和blaTEM基因的高攜帶率，是引起CRAB的重要因素。掌握碳青霉烯酶基因的攜帶情況有助于監(jiān)測并規(guī)范碳青霉烯類抗生素的使用。

參考文獻(xiàn)：

由前文可知，公式(36)關(guān)于q的一階和二階導(dǎo)數(shù)為公式(37)、(38).由于二階導(dǎo)數(shù)小于零，若公式(37)等于零，必有最優(yōu)訂貨量其解析解可通過公式(39)解得.

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