Nanoceria預(yù)處理對大鼠缺血再灌注損傷心肌組織中HO-1和NQO1蛋白表達(dá)的影響

黃真鋒，法憲恩，朱方濤，王宏山，高成山，柳 兵

(1. 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院心臟大血管外科，河南鄭州 450014；2. 鄭州市第七人民醫(yī)院心臟大血管外科，河南鄭州 450000)

心肌缺血再灌注損傷是影響心臟冠狀動脈溶栓、體外循環(huán)手術(shù)等患者病情恢復(fù)的一個重要因素，其中氧自由基的大量產(chǎn)生參與損傷過程是主要原因。有研究表明，二氧化鈰納米顆粒(nanoceria, cerium oxide nanoparticles, CeO2nanoparticle)具有清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基及抗氧化損傷作用，對缺血再灌注損傷心肌有保護(hù)作用[1]。血紅素氧化酶-1(hemeoxygenase 1, HO-1)和醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase, NQO1)是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，能誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞啟動保護(hù)機(jī)制，從而保護(hù)機(jī)體心臟免于氧化應(yīng)激所致的損傷，也正因為此，它被認(rèn)為是一種心臟保護(hù)的重要蛋白酶[2-4]。CeO2納米顆粒是否可以激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)細(xì)胞保護(hù)性基因ho-1、nqo1 mRNA等，進(jìn)而保護(hù)心肌，尚待進(jìn)一步研究。本研究通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型，觀察CeO2納米顆粒預(yù)處理對心肌組織中HO-1、NQO1蛋白表達(dá)的影響，探討其對大鼠缺血再灌注損傷心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量250～280 g，購自河南省實驗動物中心，實驗過程中對動物的處理符合鄭州大學(xué)動物倫理學(xué)要求。1～10 nm、10～25 nm、50 nm粒徑CeO2納米顆粒分別購自美國Sciventions公司(批號：191CO)、美國Sigma公司(批號：554841)、北京納辰科技發(fā)展有限責(zé)任公司(批號：NP422-1)。HE系列染色液購自北京化工廠，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2實驗分組將實驗大鼠隨機(jī)分為：缺血再灌注模型組(I/R組)、1～10 nm粒徑預(yù)處理組、10～25 nm粒徑預(yù)處理組、50 nm粒徑預(yù)處理組及假手術(shù)組(sham組)，每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1周后進(jìn)行模型制作，腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.3 mg/g)麻醉。假手術(shù)組：術(shù)前24 h經(jīng)大鼠尾靜脈注射PBS緩沖液(2 mL/kg)，心臟左前降支只穿線不結(jié)扎。I/R組：建立心肌缺血再灌注模型，具體操作可參見朱方濤等[2]制作大鼠缺血再灌注模型方法。CeO2納米顆粒預(yù)處理組：3種不同粒徑組均于術(shù)前24 h經(jīng)尾靜脈注射1 mg/mL各自粒徑的CeO2納米懸液(2 mL/kg)，其余步驟同I/R組。

1.3心肌組織病理學(xué)觀察解剖取出實驗大鼠心臟，快速放入生理鹽水(4 ℃)中，排凈心腔內(nèi)血液，然后剪取左心室結(jié)扎線遠(yuǎn)端并且相同位置的再灌注損傷區(qū)心肌，快速放入-80 ℃冰箱中冷凍保存。標(biāo)本經(jīng)100 mL/L甲醛溶液固定24 h后進(jìn)行HE染色。

1.4心肌組織中HO-1、NQO1蛋白的檢測制備SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行樣本變性和電泳，使用Western blot方法檢測心肌組織中HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)，實驗結(jié)果以相對灰度值表示。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變采用HE染色處理各實驗組標(biāo)本，光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，sham組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壞死(圖1A)。I/R組心肌細(xì)胞明顯腫脹，可見區(qū)域性呈紅染的壞死區(qū)，分辨不清界限，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)大片炎性細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤(圖1B)。在不同粒徑CeO2納米顆粒預(yù)處理組中，心肌纖維完整性相對較好，細(xì)胞間質(zhì)水腫情況較I/R組明顯減輕，偶見炎性細(xì)胞浸潤(圖1C～E)。

2.2各組大鼠心肌組織中HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)情況如表1、圖2所示，與sham組比較，I/R組心肌組織中HO-1的蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)，NQO1的蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與I/R組比較，3個不同粒徑預(yù)處理組心肌HO-1的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，NQO1蛋白的表達(dá)量均增加，但只在1～10 nm粒徑組和10～25 nm粒徑組中有顯著上升(P<0.05)，其中10～25 nm粒徑組HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)量最高(P<0.05)。

圖1各組大鼠心肌組織的形態(tài)學(xué)觀察

Fig.1 Morphological observation of the myocardium in each group (HE, ×200)

A：sham組；B：I/R組；C：1～10 nm粒徑組；D：10～25 nm粒徑組；E：50 nm粒徑組。

表1各組大鼠心肌組織中HO-1和NQO1蛋白表達(dá)情況

組別HO?1蛋白NQO1蛋白sham組0．207±0．0300．175±0．008I/R組0．315±0．038?0．178±0．0071～10nm粒徑組0．411±0．072#△0．213±0．009#△10～25nm粒徑組0．462±0．074#0．275±0．009#50nm粒徑組0．362±0．022#△0．200±0．006△

與sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05；與10～25 nm粒徑組比較，△P<0.05。

圖2Westernblot檢測HO-1及NQO1在各組大鼠心肌中的表達(dá)

Fig.2 Expressions of HO-1 and NQO1 in the myocardium detected by Western blot

3 討 論

近年來，隨著納米相關(guān)新技術(shù)逐步發(fā)展，CeO2納米顆粒因合成技術(shù)成熟，且具有較小的粒徑、比表面積相對較大的特點，以及獨(dú)特的吸收氧或釋放氧的能力，具有再生清除自由基的潛能，成為近年來生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域研究的焦點[5-6]。ho-1和nqo1 mRNA是核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號通路中下游控制的一些重要酶基因中的關(guān)鍵性靶基因，這些酶包括抗氧化物酶和解毒酶。機(jī)體中存在的HO-1能將血紅素催化生成膽綠素、鐵離子和一氧化碳等產(chǎn)物，通過這些產(chǎn)物實現(xiàn)其細(xì)胞保護(hù)作用[7]，YU等[8]指出膽綠素具有強(qiáng)大的自由基清除能力；JOHN等[9]研究提示鐵蛋白的重鏈具有抗氧化的特性，可以減輕細(xì)胞氧化損傷；一氧化碳是一種氣體信使，參與機(jī)體的一系列生理生化反應(yīng)[10]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高水平表達(dá)HO-1的小鼠在缺血再灌注損傷過程中心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生率比正常組明顯降低[11]。本研究結(jié)果顯示大鼠缺血再灌注損傷后，經(jīng)CeO2納米顆粒預(yù)處理可減輕心肌組織的病理改變程度。

由于CeO2納米顆粒是一種納米量級的材料，其表面光滑度、晶體結(jié)構(gòu)、孔隙度等理化特性對于其生物學(xué)反應(yīng)起著重要影響，納米粒徑越小，其比表面積越大，所以研究者也一直在探尋CeO2納米顆粒的最適粒徑，以發(fā)揮最佳的生物學(xué)效應(yīng)。SINGH等[12]研究發(fā)現(xiàn)，7 nm相比10 nm粒徑的CeO2納米顆粒具有更大的比表面積，但其清除機(jī)體自由基的生物學(xué)效能卻低于10 nm的CeO2納米顆粒，這可能是由于具有較大比表面積的小粒徑納米顆粒能夠產(chǎn)生過量的自由基清除劑，從而對機(jī)體正常的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生了不利的效應(yīng)。另有LIMBACH等[13]認(rèn)為較大粒徑的CeO2納米顆粒，由于其粒徑過大而無法較好地與細(xì)胞相互作用；而較小的納米粒徑，由于其更易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，也會阻礙其與細(xì)胞的作用。本實驗結(jié)果提示，50 nm的CeO2納米顆粒預(yù)處理組NQO1蛋白表達(dá)與I/R組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異。因此，尋找最適的CeO2納米顆粒粒徑，能夠最大效率地發(fā)揮其保護(hù)細(xì)胞功能，從而更好的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，不同CeO2納米顆粒納米粒徑對心肌保護(hù)作用存在差異性，其中10～25 nm量級的CeO2納米顆粒能夠最有效地上調(diào)HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)，對心肌細(xì)胞保護(hù)作用最優(yōu)。

NQO1是參與機(jī)體代謝的重要解毒酶，廣泛存在于真核生物細(xì)胞中。其可催化醌雙電子還原反應(yīng)，并且能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)的損傷。本實驗結(jié)果提示，I/R中HO-1的蛋白表達(dá)較sham組明顯升高，說明缺血再灌注損傷作為一種應(yīng)激性刺激源，可誘導(dǎo)大鼠心肌組織中HO-1的蛋白表達(dá)上調(diào)。而經(jīng)CeO2納米顆粒預(yù)處理可促進(jìn)HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)量進(jìn)一步明顯升高，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。HO-1、NQO1 mRNA是能夠被Nrf2信號傳導(dǎo)通路激活并啟動的內(nèi)源性保護(hù)基因之一，這對于進(jìn)一步研究CeO2納米顆粒在心肌缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制有重要意義。

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