網(wǎng)織血小板與早發(fā)冠心病PCI術(shù)后遠(yuǎn)期預(yù)后的相關(guān)性

張 巖，王聰霞，劉曉喚，張春艷，胡艷超，馬維冬，賈 珊，李永勤，韓振華

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710004)

我國的冠狀動脈疾病(coronary artery disease, CAD)發(fā)病率呈逐年增高的態(tài)勢，嚴(yán)重危害人民的健康，且發(fā)病年齡越來越年輕化。早發(fā)冠狀動脈疾病(premature coronary artery disease, PCAD)是指冠心病的發(fā)病年齡為男性<45歲、女性<55歲，其患病率呈逐年增加趨勢[1]。PCAD患者中約60%存在嚴(yán)重冠狀動脈狹窄，需要經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)。應(yīng)用血清標(biāo)志物評價PCAD患者PCI術(shù)后的長期預(yù)后越來越受到研究者關(guān)注。既往研究表明，平均血小板體積(mean platelet volume, MPV)是PCI術(shù)后長期預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子[2]。而網(wǎng)織血小板(reticulated platelets, RPs)較MPV能提供更準(zhǔn)確的關(guān)于血小板生成的數(shù)據(jù)[3]。

RPs存在于未成熟的骨髓細(xì)胞中，比普通血小板具有更高的細(xì)胞質(zhì)mRNA和更強(qiáng)的活性[4]。隨著血小板胞質(zhì)成熟，RPs mRNA逐漸消失，體積逐漸減小。RPs相比普通血小板可更好反映骨髓血小板的生成率。RPs在急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome, ACS)和中風(fēng)患者中均升高[4-5]。RPs能更迅速地與膠原蛋白結(jié)合[6]，合成更多的血栓素B2，釋放更多的血清素顆粒，并表達(dá)更多的糖蛋白GP Ib和GP IIb/IIIa。這些物質(zhì)是血栓形成的易感因素。因此，本研究旨在探討RPs是否可作為PCAD患者PCI術(shù)后遠(yuǎn)期主要不良心臟血管事件(major adverse cardiac event, MACE)的獨(dú)立預(yù)測因子，是否與冠脈支架內(nèi)再狹窄(in-stent restenosis, ISR)相關(guān)。

1 研究對象及方法

1.1研究對象納入西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院2010-2014年在心血管內(nèi)科行PCI治療的300例PCAD患者。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：男性<45歲，女性<55歲；PCAD包括早發(fā)ACS和早發(fā)穩(wěn)定性心絞痛；行PCI手術(shù)包括：直接PCI；抗血小板治療與PCI手術(shù)間隔至少4 h；PCI術(shù)前服用阿司匹林300 mg，氯吡格雷300 mg。PCI術(shù)后應(yīng)用12.5 mg替羅非斑。排除標(biāo)準(zhǔn)：冠狀動脈旁路移植術(shù)；住院期間死亡者；不愿簽署知情同意書的患者；參加尚未完成的臨床實驗；心理或生理(如疾病)無法參加本研究者；無法參加隨訪的患者。對照組為冠脈造影正常者250例。研究對象均簽署倫理委員會知情同意書。

1.2血液樣本及RPs測量在接受PCI前及抗血小板治療前，清晨采集血液樣本。均從肘前靜脈取血用EDTA管收集血液標(biāo)本。為了給新的血小板釋放留有足夠的時間和避免服用阿司匹林的急性影響，其后的抗血小板治療與PCI之間相隔至少4 h，患者術(shù)前服用負(fù)荷劑量阿司匹林(300 mg)、氯吡格雷(300 mg)和靜脈應(yīng)用GPⅡb/Ⅲa受體抑制劑。

外周靜脈血800 r/min離心5 min后，將富含血小板的血漿進(jìn)行分離。檢測管里加入5 μL熒光素PE標(biāo)記的CD61單抗以區(qū)分血小板，再加入25 μL富含血小板的血漿；對照管加入5 μL熒光素PE標(biāo)記的鼠抗IgG與25 μL RPs，混勻后室溫避光孵育15 min，再分別加入溶血素100 μL，避光反應(yīng)10 min后，檢測管加入RNA試劑(TO染料-噻唑橙)0.5 mL，對照管加入PBS洗液5 mL，混勻后避光孵育染色15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。參照 Matic設(shè)計策略識別RPs。本實驗室的RPs百分比(RPs%)參考值范圍為(2.31±0.74)%。

1.3臨床預(yù)后及隨訪由經(jīng)驗豐富的護(hù)士獲取患者的詳細(xì)信息，每月通過電話聯(lián)系，對可能的MACE進(jìn)行詳細(xì)記錄。電話隨訪至PCI術(shù)后24個月。對MACE的記錄由2名隨訪者和1個獨(dú)立的心血管病學(xué)專家完成，記錄包括：復(fù)發(fā)性心肌梗死(myocardial infarction, MI)，表現(xiàn)為有心肌缺血癥狀，新的或復(fù)發(fā)性ST段在2個連續(xù)的導(dǎo)聯(lián)抬高和/或升高的心臟生物標(biāo)志物高于正常上限的2倍[7]；多支血管病變被定義為至少2個冠狀動脈造影狹窄≥50%；對梗死相關(guān)動脈(infarct-related artery, IRA)涉及任何重復(fù)血運(yùn)重建的支架，或在距斑塊5 mm的近端或遠(yuǎn)端支架邊緣定義為靶病變血運(yùn)重建(target lesion revascularization, TLR)；對IRA任何重復(fù)的血運(yùn)重建被定義為靶血管血運(yùn)重建(target vessel revascularization, TVR)。MACE包括死亡、MI或TVR。

ISR定義為冠狀動脈造影顯示支架置入節(jié)段管腔直徑狹窄≥50%參考管腔直徑。最小管腔直徑和參考血管直徑的測量以舒張末期結(jié)果為準(zhǔn)。狹窄率(%)的計算：管腔狹窄率(%)=(1-最小管腔直徑/對照管腔直徑)×100%。ISR判定通過復(fù)查造影確定，其標(biāo)準(zhǔn)是對支架近端、支架遠(yuǎn)端、支架內(nèi)3個節(jié)段進(jìn)行定量分析，支架近端和遠(yuǎn)端是指支架內(nèi)距離支架邊緣5 mm的范圍。

2 結(jié) 果

2.1各組患者一般臨床資料及ISR的比較在研究期間，300例PCAD患者接受了PCI術(shù)。10例患者因各種原因在隨訪期間失訪。選擇250例冠脈造影正常的患者作為對照組，其一般資料與病例組相匹配。病例組患者平均年齡(48.1±3.6)歲，分為急性冠狀動脈綜合征(ACS)和穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris, SAP)組。PCAD組與對照組之間在吸煙、糖尿病、家族史、心衰及RPs(%)之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。通過測量RPs水平不同的分組如下：RPs<8%(1組，78例)；RPs 8%～10%(2組，82例)；RPs>10%(3組，130例)。PCAD組與對照組相比，RPs(%)明顯升高。RPs(%)最高組更容易出現(xiàn)ACS(表1)。同時，對3組患者支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率進(jìn)行兩兩對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.042)，而且3組明顯高于1組(P<0.05，表2)。

表1患者基線資料及臨床情況的比較

Tab.1 Comparison of baseline and clinical characteristics

項目PCAD(n=290)ACS(n=109)SAP(n=181)對照組(n=250)年齡(歲)48．12±3．6146．32±4．3449．90±2．7346．75±4．52男性[n(%)]208(71．72)86(78．89)122(67．40)175(70．00)吸煙[n(%)]126(43．44)?52(47．71)?73(40．33)?54(21．60)糖尿病[n(%)]47(16．21)?21(19．27)?25(13．81)?22(8．80)BMI(kg/m2)24．32±3．2124．64±3．7323．91±4．9523．54±2．52高血壓[n(%)]156(53．79)64(58．72)91(50．27)76(30．40)高脂血癥[n(%)]196(67．59)71(65．13)124(68．51)104(41．60)家族史[n(%)]55(18．97)?23(21．10)?32(17．68)?19(7．60)HF[n(%)]17(5．86)?11(10．09)?6(3．31)?5(2．00)尿素氮(mmol/L)5．32±1．715．63±1．475．00±1．234．57±1．82肌酐(μmol/L)87．23±21．6291．83±19．2792．75±20．3361．53±16．42TnI(+)[n(%)]80(27．59)?75(68．81)?1(0．55)0(0)冠脈病變支數(shù)[n(%)] 1195(67．24)68(62．38)127(70．17) - 259(20．34)16(14．68)43(23．75) - 335(12．07)22(20．18)9(4．97) -RPs(%)9．32±4．3113．52±2．92?9．61±3．157．32±2．23血小板數(shù)量(×109)223±67．81 247±71．14213±69．62219±70．47平均血小板體積(fl)9．52±1．17?10．22±1．53?9．17±1．788．24±2．08

與對照組相比，*P<0.05。BMI：身體質(zhì)量指數(shù)；TnI：肌鈣蛋白；RPs：網(wǎng)織血小板；HF：心力衰竭。

表2不同水平RPs(%)組與ISR發(fā)生的分析

Tab.2 Analysis of groups of different RPs(%) level and occurrence of ISR

組別例數(shù)(n)支架數(shù)量(n)RPs(%)ISR[n(%)]1組78866．61±0．92 2(2．32)2組82988．93±0．79 4(4．08)3組13014611．12±0．8610(7．69)P<0．050．042

2.2心血管不良事件的隨訪數(shù)據(jù)隨訪時間的中位數(shù)為2.05年[1.96～2.09年，平均(2.01±0.6)年]，20例(6.7%)患者在隨訪期間經(jīng)歷了主要心血管不良事件；9例復(fù)發(fā)性心肌梗死，16例ISR，3例TLR，4例TVR，8例出現(xiàn)復(fù)雜的心功能不全。10例(3.0%)患者死亡，其中7例為心源性死亡。

2.3Cox比例風(fēng)險回歸分析Cox比例風(fēng)險回歸分析表明，吸煙(HR=2.31，95%CI：1.47～4.87，P=0.03)、心衰(HR=2.14，95%可信區(qū)間：1.32～4.95，P<0.01)、TnI(+)(HR=2.72，95%可信區(qū)間：1.57～4.37，P<0.01)、MPV>9.1 fl(HR=2.65，95%可信區(qū)間：1.34～4.69，P=0.04)和RPs>10%(HR=2.58，95%可信區(qū)間：1.12～5.35，P<0.01)與MACE發(fā)生率相關(guān)(表3)。RPs>10%對PCI術(shù)后心臟事件的發(fā)生有顯著的預(yù)測作用，而且在調(diào)整了性別、年齡和動脈粥樣硬化的危險因素后，RPs>10%仍為獨(dú)立預(yù)測因子(校正HR=2.62，95%可信區(qū)間：1.29～6.54，P=0.02)。

表3PCAD患者行PCI術(shù)后的預(yù)測變量Cox風(fēng)險比例回歸分析

Tab.3 Variables as predictors of PCAD cardiac events after PCI

項目患者(n)MACE(n)HR(95%CI)PAdjustHR(95%CI)P吸煙13032．31(1．47～4．87)P=0．032．56(1．13～5．74)P=0．04糖尿病4811．87(0．96～3．12)P=0．212．11(0．91～3．75)P=0．19高血壓16021．20(0．86～2．67)P=0．131．31(0．76～3．33)P=0．11高脂血癥20110．98(0．69～1．57)P=0．271．27(0．68～3．79)P=0．21家族史5611．19(0．75～1．98)P=0．081．31(0．73～4．12)P=0．07HF1832．14(1．32～4．95)P<0．012．87(1．31～6．87)P=0．01TnI(+)9942．72(1．57～4．37)P<0．013．15(1．27～9．23)P=0．02MPV>9．1fl9532．65(1．34～4．69)P=0．042．89(1．09～4．23)P=0．02RPs(%) 6%～8%6410．99(0．95～2．73)P=0．071．52(0．91～3．34)P=0．06 8%～10%14621．43(0．98～3．37)P=0．061．89(0．92～3．76)P=0．06 >10%8632．58(1．12～5．35)P<0．012．62(1．29～6．54)P=0．02

TnI：肌鈣蛋白；MPV：平均血小板體積；RPs：網(wǎng)織血小板；HF：心力衰竭。

2.4ROC曲線及Kaplan-Meier生存分析分別選取MPV、肌鈣蛋白(TnI)(+)，和RPs>10%進(jìn)行ROC曲線下面積的計算，RPs>10%與MPV、TnI(+)ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。PCAD患者的多因素分析表明，TnI(OR=1.95，95%CI： 1.14～3.36)和RPs>10%(OR=2.58，95%CI：1.12～5.35)可作為主要終點(diǎn)的獨(dú)立預(yù)測因子。Kaplan-Meier事件生存率曲線顯示，RPs>10%比RPs<10%心血管事件發(fā)生率高(P<0.05，圖2)。

圖1RPs>10%與MPV及TnI(+)的ROC曲線

Fig.1 ROC curve for RPs>10%, MPV and TnI(+)

3 討 論

RPs因與網(wǎng)織紅細(xì)胞相似而命名，通過噻唑橙染色發(fā)現(xiàn)其核糖核酸產(chǎn)生網(wǎng)狀模式形成新的血小板[7]。

圖2RPs、HF、TnI(+)與PCAD行PCI術(shù)后的遠(yuǎn)期預(yù)后的分析

Fig.2 Association of changes of RPs, HF and TnI(+) with long-term cardiac events in PCAD after PCI

網(wǎng)織血小板在循環(huán)系統(tǒng)疾病中的比例增加，使血栓生成的風(fēng)險提高，同時增加血小板的聚集[8-9]。

新生成的RPs在急性冠脈綜合征和腦卒中增加，也認(rèn)為其是活性更強(qiáng)的血小板。本研究證實了RPs在PCAD組明顯增加，特別是在早期ACS中。因此，RPs可能參與血栓形成，特別是參與不穩(wěn)定斑塊的生成。

RPs在預(yù)測心臟不良事件中的作用未知。本研究旨在較大的患者隊列中研究評估RPs的基線水平及與PCAD行PCI的患者長期預(yù)后是否存在關(guān)聯(lián)。本研究采用較為簡單的流式細(xì)胞儀技術(shù)測量RPs，直接經(jīng)全血測定。測量值與骨髓血小板生成活性有關(guān)。

本研究采用Cox比例風(fēng)險回歸分析表明，RPs是心臟不良事件的獨(dú)立預(yù)測因子。同時，吸煙和心力衰竭也對心臟事件有預(yù)測作用。多因素回歸分析后，升高的RPs仍為2年內(nèi)主要心臟不良事件的預(yù)測因子。同時，RPs的升高與ISR存在相關(guān)性，本研究顯示，在RPs>10%組ISR的發(fā)生率與RPs 6%～8%組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

SANDRO等[10]研究顯示，MPV升高和心血管疾病長期的臨床結(jié)果如心肌梗死的關(guān)系密切。NAGEH等[2]研究顯示，TnI(+)是預(yù)測PCI術(shù)后6個月主要心臟不良事件的預(yù)測因子。本研究結(jié)果顯示，TnI(+)與2年的MACE結(jié)果的關(guān)系與以往的ROC分析結(jié)果相似[11]。此外，RPs>10%與TnI和MPV的曲線下面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義。RPs增高尤其是RPs>10%是PCAD患者行PCI術(shù)后的主要心臟不良事件發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測因子。

同時，本研究的數(shù)據(jù)分析顯示了RPs與2年隨訪中MACE之間的關(guān)聯(lián)。Kaplan-Meier曲線的事件生存率支持了RPs>10%是可預(yù)測PACD患者PCI術(shù)后不良事件的生物標(biāo)志物，并且證明了隨著時間的推移，RPs>10%與長期心血管事件發(fā)生的關(guān)聯(lián)更強(qiáng)。

本研究的局限性主要是在300例患者隊列中進(jìn)行RPs和臨床數(shù)據(jù)的回顧性分析。可以推斷，阿司匹林或氯吡格雷可能通過抑制血小板活化影響RPs的活性。本研究納入的患者均使用了抗血小板藥物，可能影響了抗血小板治療后RPs的生成。此外，冠脈支架內(nèi)再狹窄與多種因素有關(guān)，如支架的種類，支架的放置部位、支架的大小、支架放置的數(shù)量、后擴(kuò)的程度，這使本研究的RPs%值與冠脈再狹窄的關(guān)系可能存在一定的局限性，尚需今后進(jìn)一步探討。

總之，RPs測定是一個反映血小板生成、血小板循環(huán)和活性的可靠標(biāo)志物，且容易測試。本研究結(jié)果表明，RPs>10%與ISR相關(guān)，RPs升高尤其是RPs>10%是PCAD患者行PCI術(shù)后長期預(yù)后及MACE事件的獨(dú)立預(yù)測因子。

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