低滲溫熱灌注對小鼠肝癌腹水瘤的抑制作用

陳 強，劉師宇，杜寧芳，李思佳，顧美晨，杜海英*

(吉林大學公共衛(wèi)生學院 1.預防醫(yī)學實驗教學中心;2.衛(wèi)生毒理學教研室，吉林 長春130021)

腹腔低滲熱灌注化療已被廣泛嘗試用于預防一些惡性腫瘤導致的腹腔種植轉(zhuǎn)移[1]。臨床針對胃癌、結(jié)直腸癌術中的處理研究較多，包括廣泛的多次腹腔灌洗、腹腔內(nèi)溫熱灌注化療、持續(xù)高溫腹腔灌洗等[2-4]。我們采用小鼠肝癌腹水瘤腹腔接種模型，觀察不同溫度的某低滲液及與化療藥物聯(lián)合應用，對肝癌腹水瘤的生長抑制作用及其可能產(chǎn)生的副作用。探討能夠結(jié)合熱化療藥物達到最佳作用的灌注液介質(zhì)，為腹腔內(nèi)溫熱低滲化療應用于臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物昆明小鼠80只，SPF級，健康成年雄性，體重22-25 g，遼寧長生生物技術股份有限公司，適應性飼養(yǎng)5天，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2實驗試劑低滲溶液(長春呈實健康實業(yè)有限公司)，注射用順鉑(DDP，10 mg/支，齊魯制藥廠)。

1.3方法

1.3.1H22細胞復蘇腹腔傳代 小鼠腹水型肝癌細胞H22，由本實驗室提供。取凍存的H22細胞，于37℃恒溫水浴中迅速解凍，加入適量生理鹽水混勻離心1000 rpm 5 min；洗滌三次；臺盼蘭染色進行活細胞計數(shù)，制成單細胞懸液1×107/ml，每只小鼠腹腔內(nèi)注射 0.1 ml(1×106/只)進行第一次腹腔接種。

1.3.2小鼠肝癌腹水模型的建立 腹水形成后，脫臼處死小鼠，浸泡于75%乙醇1-2 min后，置于超凈工作臺。抽取腹水，加入生理鹽水懸浮稀釋，1 000 rpm 5 min離心洗滌三次，稀釋細胞濃度為1×107/ml，每只小鼠腹腔注射 0.1 ml(1×106/只)建立肝癌腹水模型。

1.3.3動物分組與處理 小鼠隨機分為4組，每組16只，腹腔接種瘤細胞24小時后：①對照組：腹腔注射37℃生理鹽水；②低滲組：腹腔注射37℃低滲液；③低滲熱灌注組A：腹腔注射43℃低滲液；④低滲熱灌注組B：腹腔注射45℃低滲液；⑤低滲熱灌注化療組：腹腔注射43℃低滲液+順鉑(DDP)；注藥液量為2 ml/只，化療藥DDP的濃度為0.05 mg/ ml(每只鼠給藥量為2.5 mg/kg)。接種后第1、8天各灌注1次，共2次。

1.3.4觀察與檢測指標 ①接種后，每3日測鼠重、測量腹圍，進行腹腔穿刺觀察腹水產(chǎn)生時間；小鼠死亡時計腹水量；②小鼠出現(xiàn)腹水時每只取0.5 ml，按白細胞計數(shù)計瘤細胞總數(shù)；用臺盼藍染色計瘤細胞存活率；③移植瘤生長潛伏期、移植率、荷瘤生存期和生命延長率；生命延長率(%)=(實驗組平均生存天數(shù)/對照組平均生存天數(shù)-1)×100%。④解剖觀察胸、腹腔內(nèi)臟器官的病理變化。

2 結(jié)果

2.1荷瘤模型觀察

腹腔內(nèi)注射瘤細胞 1×106/只建立荷瘤模型，對照組明顯腹水形成潛伏期為7.5±0.5 天，移植率達100%，腹部增大膨隆明顯，狀如蛙腹；低滲組和低滲熱灌注組腹部增大較??；而低滲熱化療組腹部增大不明顯，死亡后未見腹水。

2.2大體觀察

給藥后兩周內(nèi)，對照組未出現(xiàn)死亡。低滲液37℃灌注后，對腹水瘤的產(chǎn)生有較好的抑制作用，能夠明顯延長實驗動物的生存期，大體觀察發(fā)現(xiàn)該組小鼠腹水增長緩慢，小鼠狀態(tài)良好。低滲熱灌注組和低滲熱化療組動物死亡早(最早死亡在第3天)，死亡率較高(分別達43.8%、37.5%)，且大體狀態(tài)較差，體重增長緩慢，但平均生存期明顯延長。

2.3體重變化

對照組隨著腹水量產(chǎn)生的增加，體重增加明顯；低滲組和低滲熱灌注組體重略有增加且趨勢相同；低滲熱化療組給予灌注后，體重呈下降趨勢明顯。

圖1 各組小鼠體重變化情況

2.4腹水形成期、腹圍及腹水量

建模后對照組平均腹水形成期7.5±0.5 d，平均最大腹圍13.9±2.3 cm，腹水產(chǎn)生量大，死亡后解剖均為血性腹水，平均腹水量達26.8±4.7 ml，平均腹水細胞計數(shù)6.3×107/ml。與對照組相比，低滲組和低滲熱化療組平均腹水形成期明顯延遲，各試驗組平均腹圍亦明顯小于對照組(P<0.05)，觀察到死亡后，解剖大多未見明顯腹水。

表1 各組小鼠平均腹水形成期及平均最大腹圍

*vs對照組，P<0.05；#vs低滲熱化療組，P<0.05。

2.5荷瘤生存期及生命延長率

對照組在荷瘤33天內(nèi)全部死亡，平均荷瘤生存期23.1±6.5 d；與對照組比較，低滲組和低滲熱化療組均明顯延長了荷瘤生存期，最長存活為87 d。其生命延長期分別達到97.4%和99.6%。

表1 各組小鼠平均荷瘤生存期及生命延長率

*vs對照組，P<0.05。

2.6解剖觀察

對照組解剖呈現(xiàn)腹部膨隆、腹壁繃緊發(fā)亮，大量血性腹水，肝臟均有轉(zhuǎn)移灶，個別出現(xiàn)脾臟和腹腔種植性轉(zhuǎn)移；低滲組未見腹水或腹水量很少，解剖發(fā)現(xiàn)下腹壁有大小不一的局部結(jié)節(jié)；低滲熱灌注組未見明顯腹水，有肝脾出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，肝硬化，腸道腫脹黏連，腹腔種植性轉(zhuǎn)移；低滲熱化療組死亡后亦未見腹水，肝臟受損嚴重，質(zhì)硬鈍圓，且出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的形成，脾大、腸道腫大明顯，并有節(jié)段質(zhì)堅硬，有的亦出現(xiàn)腹壁腫塊。

3 討論

癌性腹水是肝癌晚期患者常見的并發(fā)癥，對患者生存質(zhì)量會產(chǎn)生嚴重影響，亦可導致病情迅速惡化[5]。積極控制腹水能夠延長患者生命，減輕痛苦，還可為進一步的治療創(chuàng)造條件。腫瘤熱療是利用腫瘤細胞和正常細胞對溫度有著不同的耐受能力，從而殺滅腫瘤細胞[6,7]。從目前臨床有效的嘗試來看，低滲、熱療以及聯(lián)合化療之間可能存在較好的增敏作用[8-10]。

對肝癌腹腔種植轉(zhuǎn)移預防的研究，國內(nèi)外文獻報道較少。孫延富等[11]認為腹腔內(nèi)游離癌細胞的數(shù)量能夠在一定程度上預測對術后的種植轉(zhuǎn)移發(fā)生率，通過有效減少游離的癌細胞可達到預防作用。張海斌等[12]報道，應用蒸餾水對腹腔進行充分沖洗后，對肝癌術后腹腔種植有一定的預防和治療作用?？婓K等[13]報道，應用溫熱的蒸餾水在肝癌手術中進行持續(xù)灌洗10 min以上，可以殺滅游離的肝癌細胞，從而能夠預防腹腔種植轉(zhuǎn)移的發(fā)生。盡管早在20世紀60年代就開始了應用低滲蒸餾水殺滅腫瘤細胞的研究，但經(jīng)不同臨床應用發(fā)現(xiàn)，其效果并不確定。

本研究利用小鼠肝癌腹水瘤模型，行腹腔內(nèi)保留式低滲、溫熱化療，探討某低滲液溫熱灌注以及聯(lián)合化療對腹水型肝癌的抑制作用，探討其預防復發(fā)、轉(zhuǎn)移的價值。實驗結(jié)果顯示，在荷瘤模型建立初期，腹腔灌注給予不同溫度的低滲液，能夠有效延長肝癌腹水形成期；通過體重、腹圍、腹水量的觀察，各試驗組顯著抑制了腹水的形成；低滲組和低滲熱化療組有效延長了荷瘤生存期和生命延長率，差異有統(tǒng)計學意義；但從解剖和大體觀察來看，低滲熱灌注組及低滲熱化療組對小鼠腹腔內(nèi)臟器造成較大損傷，建模后兩周內(nèi)死亡率較高。這與臨床應用并不一致。一般認為，腫瘤熱療的最佳溫度為42.5℃-44℃， 低于 41℃無明顯療效，高于44℃ 可能對正常細胞造成損傷[1]。但我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，采用37℃溫熱灌注在控制腹水、延長生存期以及實驗動物存活狀態(tài)等方面，均優(yōu)于較高的溫度灌注以及聯(lián)合化療的作用，特別是較高溫度灌注后，實驗動物在短期內(nèi)死亡率較高，聯(lián)合化療雖然有效延長了生存期，但化療藥物的副作用明顯影響了實驗動物的存活狀態(tài)，解剖觀察發(fā)現(xiàn)腹腔臟器損傷較嚴重。

本研究結(jié)果以期為某低滲液應用于預防肝癌腹腔種植轉(zhuǎn)移提供實驗依據(jù)，其作用機理及對機體產(chǎn)生的影響有待進一步深入研究。

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