Xpert MTB/RIF和熒光定量PCR在痰液標本中快速檢測結(jié)核分支桿菌的比較

杜 鵬，鄭文斌，盧留珠，吳健虹，張 琦，呂純芳，張 濤

(深圳市南山區(qū)慢性病防治院，廣東 深圳518054)

結(jié)核病作為全球最嚴重的公共衛(wèi)生威脅，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的2015年全球結(jié)核病報告顯示結(jié)核菌的感染率首次逼近艾滋病，2014年共有960萬新發(fā)結(jié)核病病例，150萬人死于結(jié)核病，其中40萬人同時感染了艾滋病毒。我國2014年新發(fā)結(jié)核病病例93萬，僅次于印度與印度尼西亞而位居全球第三[1]。結(jié)核病防控的一個重要方面是快速、有效診斷。2010年12月，WHO推薦Xpert MTB/RIF(Xpert)作為結(jié)核病的快速診斷及對利福平的耐藥性檢測，它不僅具有高敏感性與特異性，并且能在2小時內(nèi)完成檢測。Xpert以半巢式實時定量PCR擴增技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)rpoB的利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)設(shè)計引物與探針，所以能同步檢測是否為利福平耐藥菌株。熒光定量PCR作為另一種在全球結(jié)核病診斷中廣泛應(yīng)用的核酸擴增檢測(NAAT)技術(shù)，國產(chǎn)熒光定量PCR檢測方法與Xpert的比較評估不多，本研究旨在以MGIT960結(jié)核菌培養(yǎng)為金標準，比較Xpert和國產(chǎn)熒光定量PCR在結(jié)核病快速檢測方面的應(yīng)用，為基層實驗室在結(jié)核病快速核酸檢測方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1標本收集收集2014年7-2015年8月在深圳市南山區(qū)慢性病防治院肺科門診就診患者的痰標本183份。年齡范圍16-81歲，男121份，女62份；初診170份，復(fù)診13份。

1.2主要試劑和儀器Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)與試劑(美國 Cepheid)，抗酸染色試劑(珠海貝索)，顯微鏡(奧林巴斯)，BACTEC MGIT 960系統(tǒng)及試劑(美國 BD)，熒光定量PCR儀(Lightcycler 480Ⅱ，羅氏)，結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒(湖南圣湘)。

1.3方法

1.3.1標本留取 每個患者要求送早、晚、隨機痰液標本三份，挑取痰液質(zhì)量好的部分用于涂片鏡檢，余下的痰液混勻，一份用于Xpert檢測，一份用于BACTEC MGIT 960的培養(yǎng)，一份用于結(jié)核桿菌熒光定量PCR的檢測。

1.3.2Xpert檢測方法 取1 ml痰標本加入有螺旋蓋的50 ml離心管中，加入兩倍痰標本體積的樣本處理液(Sample Reagent)，渦旋振蕩20 s左右，直至無肉眼可見塊狀痰。室溫放置15 min，使痰液充分消化，用無菌吸管吸取2 ml處理后痰液，緩慢加入Cartridge 反應(yīng)盒中；將反應(yīng)盒放入Xpert儀器中，按操作規(guī)程進行操作，2h后儀器自動判讀結(jié)果。按照儀器說明書，5個探針中至少有2個探針Ct值≤38 即為檢測到結(jié)核桿菌，Ct值<16為高含量，Ct 值16-22 為中等含量，Ct 值22-28 為低含量，Ct 值>28 為極低含量。

1.3.3MGIT 960培養(yǎng)方法 取適量痰標本加入50 ml離心管，視痰性狀加入1-2倍體積4% NaOH-NALC，渦漩振蕩混勻2-3 min，室溫放置15-20 min后加入0.1M無菌pH 6.8磷酸鹽緩沖液至50 ml；3 000 rpm/min低溫離心15 min，棄上清，加入1-2 ml 0.1 M無菌pH6.8磷酸鹽緩沖液，混勻；將營養(yǎng)添加劑 GrowthSupplement倒入雜菌抑制劑 PANTA試劑瓶中，充分溶解混勻后吸取0.8 ml加入到 MGIT7 ml液體培養(yǎng)管中，然后再加入0.5 ml 標本；將培養(yǎng)管移入MGIT 960儀器中，按操作規(guī)程進行操作。

1.3.4熒光定量PCR檢測 取適量痰標本加入50 ml離心管，視痰性狀加入2-3倍體積4%的NaOH溶液，震蕩混勻后靜置30 min；取液化后的樣本500 μl加入無菌離心管中，10 000 rpm離心3 min，棄上清，加入1 ml生理鹽水重懸；再次12 000 rpm離心3 min，棄上清，加入50 μl核酸釋放劑，100℃恒溫加熱10 min，然后12 000 rpm/min離心3 min，取上清作為待測樣本。于PCR管中分別加入前處理的樣本、陰性對照、陽性對照各5 μl，每管加入PCR-Mix(反應(yīng)液38 μl+酶混合液2 μl+內(nèi)標1 μl)40 μl，蓋上管蓋，2 000 rpm離心30 s，移入熒光定量PCR儀中；擴增程序如下：50℃ 2min；94℃ 2 min；94℃ 5 sec、57℃ 30 sec(45 cyclers)；40℃ 10 sec。

1.4統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，Xpert和熒光定量PCR法檢測結(jié)果比較用配對χ2檢驗，P<0.05為顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1比較Xpert和熒光定量PCR的靈敏度和特異性

收集的183份痰標本進行了上述三種方法的檢測，有10份痰標本MGIT960培養(yǎng)為污染，有效樣本為173份。在173份樣本中，有93份樣本MGIT960培養(yǎng)陽性，陽性率為53.8%(93/173)；86份樣本Xpert檢測為陽性，靈敏度為84.95%(79/93)，特異性為91.25%(73/80)；82份樣本熒光定量PCR檢測為陽性，靈敏度為80.6%(75/93)，特異性為91.25%(73/80)。Xpert與熒光定量PCR兩種方法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.747，P>0.05)(詳見表1)。

表1 痰液中結(jié)核桿菌Xpert、熒光定量PCR以及MGIT960法檢測結(jié)果的比較

2.2Xpert與熒光定量PCR檢測陽性而MGIT960培養(yǎng)陰性的結(jié)果

在173份痰樣本中，有7份樣本是MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為陰性，但Xpert和熒光定量PCR 檢測結(jié)果為陽性。這7份樣本中有3份為復(fù)診樣本，4份為初診樣本。初診樣本Xpert檢測結(jié)果等級為低含量的有3份，極低含量的有1份。

2.3Xpert與熒光定量PCR檢測結(jié)果不一致的結(jié)果

在173份痰樣本中，有8份樣本Xpert與熒光定量PCR檢測不一致，其中7份樣本為Xpert陽性而熒光定量PCR陰性，1份樣本為Xpert陰性而熒光定量PCR陽性，具體結(jié)果見表2。

表2 結(jié)核桿菌Xpert與熒光定量PCR檢測結(jié)果不一致標本分析

注：※MGIT 960培養(yǎng)液抗酸染色鏡檢時發(fā)現(xiàn)桿菌不規(guī)則排列，疑似有非結(jié)核分枝桿菌的混合感染

3 討論

結(jié)核病作為一種人間傳播疾病，有效快速的診斷是結(jié)核病防控的關(guān)鍵[2]?，F(xiàn)有的結(jié)核病診斷方法中，抗酸染色雖然簡便，但靈敏性太差；液體培養(yǎng)的靈敏性雖然高，但耗時長，延誤疾病的診斷與治療。隨著核酸檢測技術(shù)的進步，熒光定量PCR得以廣泛應(yīng)用，它的主要優(yōu)點在于縮短了檢測周期，全自動操作程序既減少了手工操作，同時還降低了交叉污染的風險[3]。

本研究共有183份樣本，有10份樣本MGIT 960培養(yǎng)為污染，污染率為5.5%，基本符合臨床TB實驗室污染控制要求。余下的173份樣本， Xpert檢測無效的有8份，無效率為4.37%，低于Elisa Ardizzoni[4]所報道的6.3%的無效率，無效檢測不僅提高了檢測費用，還造成了樣本的浪費。對于檢測結(jié)果無效的樣本，我們?nèi)≡瓨釉俅螜z測，檢測結(jié)果為有效。無效檢測產(chǎn)生的原因可能有：(1)痰液液化不充分，有顆粒的存在；(2)消化液中有氣泡；(3)消化后樣本中殘留PCR抑制物；(4)試劑質(zhì)量問題。173份樣本，MGIT 960培養(yǎng)陽性的有93份，其中Xpert檢測陽性的有79份，熒光定量PCR檢測陽性的有75份。以培養(yǎng)結(jié)果為金標準，Xpert檢測靈敏度為84.9%(79/93)，特異性為91.25%(73/80)；熒光定量PCR檢測靈敏度為80.6%(75/93)，特異性為91.25%(73/80)，兩種方法的靈敏度與特異性都較好，Xpert的靈敏度比熒光定量PCR稍微高些，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.747，P>0.05)。

目前國內(nèi)對Xpert檢測方法和熒光定量PCR在結(jié)核病快速檢測方面的比較研究很少，高漫[5]等人的研究發(fā)現(xiàn)Xpert的靈敏度為65.9%，特異性為100%；劉慧梅[6]等人的研究發(fā)現(xiàn)Xpert的靈敏度是75.8%，特異性是79.7%；國外有研究發(fā)現(xiàn)，Xpert的靈敏度為50%-95%，特異性為94%-98%，熒光定量PCR的靈敏度為46%-78%，特異性為98%-100%。兩種檢測方法的靈敏度差異太大主要在于檢測樣本種類與來源、以及熒光定量檢測試劑的不同[2,7-9]。本研究中，Xpert的靈敏度高于熒光定量PCR的原因可能有：(1)樣本都為痰液，沒有肺外結(jié)核的樣本；(2)痰涂片陰性樣本占71.6%，陽性比例較高。但我們也發(fā)現(xiàn)Xpert并沒有達到理論上的高靈敏度，可能的原因有：(1)本實驗中Xper針對的是直接的樣本，沒有如國外對非痰液樣本進行濃縮[10-13]；(2)Xpert系統(tǒng)沒有去污染步驟，存在PCR抑制因子，在低菌量時影響較大[9]；(3)菌量太低，超出Xpert的檢測下限[14]。

核酸擴增檢測(NAAT)針對的是核酸上的靶序列，這決定了它的高特異性，我們發(fā)現(xiàn)了7份樣本MGIT 960培養(yǎng)為陰性，而Xpert和熒光定量PCR為陽性，我們推測最大的可能是由于死菌的存在，它們無法在液體培養(yǎng)系統(tǒng)中生長。出現(xiàn)這種培陰現(xiàn)象一方面可能為復(fù)診化療藥物的殺菌作用，這7份樣本中有3份為復(fù)診樣本；另一方面可能是去污染過程中NaOH影響了結(jié)核桿菌的活性，有研究發(fā)現(xiàn)它可以殺死高達60%的結(jié)核分枝桿菌[15]，這在低菌量時影響較大。培陰中的4份初診樣本3份Xpert報陽等級為低含量，1份為極低含量，皆為低菌量報陽樣本。為了比較Xpert和熒光定量PCR兩者的檢測差異，我們對檢測結(jié)果不一致的樣本進行分析，73份樣本中有8例樣本Xpert與熒光定量PCR檢測不一致，包括7例Xpert陽性而熒光定量PCR陰性，1例Xpert陰性而熒光定量PCR陽性。7例Xpert檢測陽性的標本，其等級基本都為極低含量，除SZ80外，培陽時間都高于13天；同時該7例樣本采用涂片鏡檢進行等級分類，只有一個為1+，其余都為陰性，Xpert的報陽等級和涂片鏡檢結(jié)果都提示為低菌量樣本。另外 1例Xpert陰性而熒光定量PCR陽性的標本培養(yǎng)報陽時間為20天，熒光定量Ct值為35.78，同樣表明樣本的含菌量很低。綜上所述，我們推測，在檢測低菌量樣本時，Xpert的表現(xiàn)優(yōu)于國產(chǎn)熒光PCR。在研究中，我們還發(fā)現(xiàn)了一例特殊樣本SZ80，該樣本經(jīng)Xpert檢測為陽性，MGIT 960培養(yǎng)后取培養(yǎng)液抗酸染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)分散排列，懷疑是結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的共同感染，我們將進一步進行確認。

Xpert系統(tǒng)和國產(chǎn)熒光定量PCR系統(tǒng)都在結(jié)核病檢測診斷方面具有良好的靈敏度和特異性，考慮到熒光定量系統(tǒng)需要進行樣本的前處理和核酸的提取，不僅增加了試驗時間，還提高了污染的風險，生物安全等級要求也較高，同時熒光定量檢測易受不同品牌檢測試劑質(zhì)量的影響；而Xpert檢測需時短、自動化程度高、試劑封閉穩(wěn)定，當然我們也不能忽視Xpert檢測昂貴的費用。綜上所述，我們應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化國產(chǎn)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，從而為基層實驗室在結(jié)核病核酸檢測方法的選擇提供參考。

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