一起副溶血弧菌感染食物中毒病原學(xué)檢測(cè)

姜大棟 李琦

1 流行病學(xué)調(diào)查

2017年05月30日20時(shí), 本疾控中心接到轄區(qū)某醫(yī)院的電話(huà), 稱(chēng)有兩批不同旅行團(tuán)人員在該醫(yī)院就診。本中心值班人員趕到醫(yī)院發(fā)現(xiàn), 分別為某內(nèi)蒙旅行團(tuán)(游客29人)及某湖北旅行團(tuán)(游客35人), 共有患者15例, 患者均在2017年05月30日12時(shí)進(jìn)食了由本轄區(qū)某旅游定點(diǎn)餐廳提供的食品,30日17時(shí)部分患者有惡心嘔吐、頭暈頭痛、腹瀉腹痛以及水樣便等臨床癥狀, 30日20時(shí)有以上中毒癥狀的患者15例。本次同時(shí)進(jìn)餐有64人, 15例發(fā)病, 潛伏期時(shí)間在5～8 h, 發(fā)病癥狀相似, 采用抗生素、補(bǔ)充液體等治療后病情好轉(zhuǎn)明顯,采集其標(biāo)本并檢測(cè)其中細(xì)菌性。

2 材料與方法

2.1 樣品 采集疑似食物中毒患者的15份肛拭子、10份殘余剩飯, 5份茶碗涂抹樣, 標(biāo)本共30份。

2.2 試劑與儀器 營(yíng)養(yǎng)肉湯、3%氯化鈉堿性?xún)鏊?、GN增菌液等所用干粉培養(yǎng)基由北京路橋技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi), API條由法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn), 法國(guó)科馬嘉顯色弧菌培養(yǎng)基, 反應(yīng)預(yù)混液及模板tdh, trh均購(gòu)自江蘇碩世生物科技工程有限公司［1］。儀器溫箱(上海新苗), 熒光定量PCR儀器(美國(guó)AB7500)。

2.3 檢測(cè)方法 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法《GB/T4789-2010》及副溶血性弧菌熒光定量PCR檢驗(yàn)方法［2］。

2.4 質(zhì)量控制 鼠傷寒沙門(mén)ATCC14028、副溶血性弧菌ATCC17802、大腸0157：H7 NCTC12900(南京宇微有限公司生產(chǎn)), PCR質(zhì)控菌株O3：K18(江蘇碩世生物科技工程有限公司 )［3］。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程及結(jié)果

3.1 樣本共30份, 送至疾控檢驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè), 具體項(xiàng)目有沙門(mén)氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌以及志賀氏菌［4］。

3.2 檢測(cè)步驟及結(jié)果

3.2.1 增菌與分離培養(yǎng) 樣品接種營(yíng)養(yǎng)肉湯、3%氯化鈉堿性?xún)鏊?、革蘭陰性桿菌增菌培養(yǎng)液(GN增菌液)、亞硒酸鈉增菌液(SF增菌液), 志和菌增菌肉湯 , 經(jīng) 37℃18～24 h增菌, 然后在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、SS瓊脂平板、科馬嘉顯色平板以及麥康凱平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)種, 嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作,對(duì)菌落的形態(tài)進(jìn)行仔細(xì)觀察, 同時(shí)選擇可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果有13份樣品在科馬嘉顯色平板上菌落呈現(xiàn)為隆起, 圓形, 淡紫色菌落, 鏡檢均為革蘭陰性無(wú)芽孢短小桿菌, 疑似副溶血性弧菌。

3.2.2 副溶血弧菌生化 初步生化見(jiàn)表1。副溶血弧菌API生化鑒定見(jiàn)表2。

表1 副溶血弧菌生化檢測(cè)結(jié)果

表2 副溶血弧菌API生化鑒定結(jié)果

3.3 血清學(xué)分型若菌株為副溶血性弧菌, 則采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂37℃進(jìn)行接種, 培養(yǎng)18～24 h, 培養(yǎng)物采用較濃3%食鹽水,在100℃溫度下進(jìn)行煮沸, 進(jìn)行(O)抗血清玻片凝集試驗(yàn), 選擇對(duì)照為使用無(wú)菌生理鹽水, 在高鹽血平板上接種13株副溶血性弧菌。結(jié)果高鹽血平板上呈現(xiàn)透明溶血環(huán), 為“神奈川現(xiàn)象”陽(yáng)性, 凝集反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性, 為O3：K6。

3.4 熒光定量PCR檢測(cè)副溶血性弧菌毒力基因tdh和trh

3.4.1 熒光PCR樣品準(zhǔn)備 將分離到的13株副溶血性弧菌劃線(xiàn)接種弧菌顯色培養(yǎng)基, 36℃培養(yǎng)18～24 h。取菌落于含1 ml生理鹽水的1.5 ml離心管中制成菌懸液, 震蕩混勻, 4000 轉(zhuǎn)離心5 min棄上清, 于原管中加入1 ml無(wú)菌超純水, 震蕩混勻, 100℃加熱15 min, 12000轉(zhuǎn)離心10 min, 取上清-20℃保存, 作為PCR擴(kuò)增模板備用。

3.4.2 熒光定量PCR體系檢測(cè) 按說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系25 μl, 體系加入隨機(jī)引物 1 μl。 PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性120 s, 45個(gè)循環(huán)［95℃變性20 s, 56℃退火28 s(檢測(cè)熒光信號(hào)), 72℃延伸30 s］。tlh基因陽(yáng)性記為副溶血性弧菌陽(yáng)性。tdh、trh 任一基因陽(yáng)性則應(yīng)判定為副溶血性弧菌毒力基因陽(yáng)性。于FAM通道檢測(cè)熒光信號(hào), CT≤35 循環(huán)為典型的S形擴(kuò)增曲線(xiàn)為陽(yáng)性。每次用質(zhì)控菌株作陽(yáng)性對(duì)照, 采用DEPC水作空白。

3.4.3 檢測(cè)結(jié)果 13株菌株tlh、tdh基因均為陽(yáng)性, trh基因均為陰性。見(jiàn)圖1。

圖1 13株副溶血性弧菌分離株tdh基因熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

4 討論

大連是一個(gè)沿海地區(qū), 餐館酒樓常會(huì)涉及到海產(chǎn)品的處理, 但是若廚具、生熟食品分開(kāi)不及時(shí), 容易造成交叉污染［5-7］。此次食物中毒事件中, 在同一飯店就餐不同旅行團(tuán)的15例患者中的12份肛拭子標(biāo)本中檢測(cè)到副溶血性弧菌,同時(shí)在l份食品樣品中檢出了副溶血性弧菌且血清型同為O3：K6；神奈川(kanagawa)試驗(yàn)顯示13株檢出的副溶血性弧菌都有溶血現(xiàn)象, 說(shuō)明這些菌株具有致病性；且全部13株菌的tdh基因呈陽(yáng)性, 提示副溶血性弧菌的污染是本次食物中毒的致病因子。

近年來(lái)熒光定量PCR技術(shù)得到廣泛應(yīng)用, 該檢測(cè)方法具有快速, 自動(dòng)化程度高, 特異性強(qiáng), 無(wú)需電泳, 污染性小的特點(diǎn)。副溶血性弧菌毒力基因的檢測(cè)已成為重要的技術(shù)手段,tdh基因在患者標(biāo)本中的檢出率很高, 但在食品和環(huán)境中的檢出較少, 而trh在患者和其它標(biāo)本中的檢出率更低, 提示其在食物中毒病原檢測(cè)中的重要性［8-10］。通過(guò)此次事件發(fā)現(xiàn)該餐廳消毒設(shè)施較差, 本地區(qū)春夏季氣溫溫暖, 容易造成海產(chǎn)品中弧菌滋生, 造成食物中毒。餐館衛(wèi)生需要衛(wèi)生監(jiān)督部門(mén)嚴(yán)格管理、監(jiān)督, 及時(shí)有效對(duì)餐館人員進(jìn)行衛(wèi)生教育宣傳,增強(qiáng)執(zhí)法力度。

［1］ 姜大棟, 趙大磊.對(duì)2013年我轄區(qū)一起由兩種菌混合感染的食物中毒的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)分析.中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)(下旬刊), 2014,24(1):472-473.

［2］ 李博, 陳輝, 袁夢(mèng), 等.一起由副溶血性弧菌引起的食物中毒病原學(xué)分析.中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)(下旬刊), 2012, 22(7):2229.

［3］ 駱艷婷, 梁景濤, 陳愛(ài)貞 , 等.佛山市副溶血弧菌病原學(xué)與分子流行病學(xué)特征.熱帶醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 16(5):677-680.

［4］ 張海央, 陳輝華, 王倩倩, 等.一起因同源進(jìn)餐致疑似副溶血弧菌感染食物中毒事件調(diào)查.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2015, 42(12):2170-2171.

［5］ 李欣彤, 陳永軍 , 劉迎春, 等 .副溶血弧菌TDH蛋白高效表達(dá)、免疫原性分析及初步應(yīng)用.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2015,23(6):56-62.

［6］ 董雪紅.副溶血弧菌誘導(dǎo)的Notch分子參與天然免疫應(yīng)答作用的初步研究.上海海洋大學(xué), 2015.

［7］ 冼鈺茵.副溶血弧菌與溶藻弧菌毒力基因分布與抗生素耐藥性分析.暨南大學(xué), 2015.

［8］ 孫海波.一起副溶血性弧菌引起的食物中毒調(diào)查.醫(yī)學(xué)信息,2015(26):288.

［9］ 徐秋芳, 童銳, 費(fèi)瓊, 等.一起副溶血性弧菌食物中毒的病原學(xué)檢測(cè)與分析.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, 33(3):377-379.

［10］ 施新萍, 胡立群, 胡薇薇.一起副溶血性弧菌引起食物中毒的病原學(xué)鑒定.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2011(6):1445-1447.