還原石墨烯對(duì)白腐菌降解脫色染料活性艷紅X-3B的影響

楊 樺，馬 強(qiáng)，馮世成，楊勝韜

(西南民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境保護(hù)工程學(xué)院，四川 成都 610041)

隨著印染行業(yè)的快速發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視印染廢水中的染料對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題.上萬(wàn)種不同的染料被應(yīng)用到印染行業(yè)，至少有10%的已用染料通過(guò)廢物進(jìn)入環(huán)境[1-2].印染廢水中的染料毒性大，吸光系數(shù)大，同時(shí)具有耐光、耐熱等特點(diǎn).其中活性艷紅X-3B屬于典型的偶氮類染料，其結(jié)構(gòu)中的磺酸基團(tuán)使得染料在水中溶解性極好，因此很難從水中去除.活性艷紅X-3B分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示.目前偶氮類染料種類最多，產(chǎn)量最大，使用量第一，降解難度大，對(duì)偶氮類染料的處理已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外工業(yè)廢水治理中的重要問(wèn)題.目前染料廢水的處理方法主要有物理法、化學(xué)法與生物法.但是物理方法無(wú)法徹底清除染料污染物，而化學(xué)方法容易引起二次污染[3].在國(guó)內(nèi)，生物法是目前染料廢水的主要處理手段.

圖1 活性艷紅X-3B分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Molecular structure of reactive brilliant red X-3B

白腐菌是一類白色的絲狀真菌，具有徹底分解降解木質(zhì)素的能力，在碳循環(huán)系統(tǒng)中扮演著至關(guān)重要的角色，其中黃孢原毛平革菌是白腐菌中分布廣泛的典型菌種.許多白腐菌被證實(shí)可以用于處理難降解的污染有機(jī)物，如木質(zhì)素香烴、合成染料等[4-6].白腐菌對(duì)染料的脫色和降解主要是依靠白腐菌降解木質(zhì)素過(guò)程中分泌的胞外酶破壞染料的發(fā)色體系，使染料脫色、降解并最終礦物化，從而達(dá)到消除染料污染的目的.因此白腐真菌在污水治理中具有廣闊的應(yīng)用前景.

石墨烯自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直備受關(guān)注，因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在諸多領(lǐng)域都有著良好的應(yīng)用前景[7-8].目前，石墨烯已在藥物[9]、電荷儲(chǔ)存[10]、傳感器[11]、復(fù)合材料[12]等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用.隨著石墨烯逐步進(jìn)入人們的生產(chǎn)生活，人們也越發(fā)重視其潛在的危害性.近年來(lái)，一些研究人員報(bào)道納米材料可能干擾白腐菌的產(chǎn)酶和分解活性[13-17].而白腐菌的產(chǎn)酶與分解過(guò)程與治理印染廢水的染料降解過(guò)程息息相關(guān)，因此，探究納米材料對(duì)白腐菌降解染料過(guò)程的影響迫在眉睫.

本文通過(guò)測(cè)定白腐菌脫色染料過(guò)程中白腐菌的質(zhì)量、培養(yǎng)體系的pH值和染料脫色率等指標(biāo)，探究RGO對(duì)黃孢原毛平革菌降解染料的影響，為探討RGO的環(huán)境生物安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 還原石墨烯的制備

本工作采用改良的Hummer’s法制備氧化石墨烯(GO)[18]，得到單一分散的 GO，再用抗壞血酸(VC)作為還原劑還原所得的GO.VC無(wú)毒環(huán)保，且反應(yīng)條件溫和[19].VC與GO質(zhì)量比1:1，在60℃恒溫水浴條件下反應(yīng)4小時(shí)，得到黑色的RGO分散液.將得到的RGO超聲洗滌至中性，然后過(guò)濾、凍干，得到純凈的RGO黑色顆粒.對(duì)得到的RGO進(jìn)行一系列的表征.

1.2 白腐菌的培養(yǎng)

真菌菌株黃孢原毛平革菌(MTCC 787)購(gòu)買于廣東省微生物保藏中心，葡萄糖馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)買于Solarbio公司.真菌在葡萄糖馬鈴薯瓊脂平板上37℃恒溫靜置黑暗培養(yǎng)7天后，用10 mL蒸餾水分散，制備得到孢子菌懸液，用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)后，將菌懸液接種到40 mL液體培養(yǎng)基中，接種量為5×105個(gè)/mL，37℃恒溫黑暗震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 rpm.液體培養(yǎng)基配方如下:葡萄糖(10 g/L)，KH2PO4(2.56 g/L)，MgSO4·7H2O(0.71 g/L)，酒石酸銨(0.2 g/L)，苯甲醇(0.54 g/L)，硫胺素(0.001 g/L)，微量元素液(70 mL/L)，乙酸(0.9 g/L)和乙酸鈉(0.9 g/L).微量元素液配方如下:氨基乙酸(0.6 g/L)，Mn-SO4·H2O(0.5 g/L)，NaCl(1 g/L)，F(xiàn)eSO4·7H2O(0.1 g/L)，CoCl2·H2O(0.19 g/L)，CaCl2·2H2O(1.56 g/L)，ZnSO4·7H2O(0.1 g/L)，CuSO4· 5H2O(0.1 g/L)，KAl(SO4)2·12H2O(0.01 g/L)，HBO3(0.01 g/L)，Na2MoO4·2H2O(0.01 g/L).液體培養(yǎng)基用乙酸調(diào)節(jié)pH至5.0，接種前均已滅菌.

1.3 RGO對(duì)白腐菌分解活性的影響

為了探究RGO對(duì)白腐菌分解活性的影響，將40 ml液體培養(yǎng)基中分別加入濃度為 0，0.25，0.5，0.75，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL 的 RGO，并用乙酸調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH值至5.0，高壓滅菌后以5×105個(gè)/mL接種量接種白腐菌孢子，37℃恒溫黑暗震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 rpm.培養(yǎng)3天后，向體系中加入1 mL濃度為30 mg/L的活性艷紅染液繼續(xù)培養(yǎng).每隔12小時(shí)從體系中取出2 mL染色培養(yǎng)液，高速離心后取上清液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)染料在538 nm處的吸光度，分析染料褪色情況.染料褪色完全后分離白腐菌與液體培養(yǎng)基，測(cè)定液體培養(yǎng)基pH值變化，并記錄白腐菌濕重，然后將白腐菌放入真空干燥箱中60℃恒溫干燥48小時(shí)，保證水分完全去除，測(cè)定白腐菌干重.

1.4 還原石墨烯吸附染料活性艷紅X-3B

RGO因其獨(dú)特的多孔片層結(jié)構(gòu)，其本身就是良好的吸附材料.為了進(jìn)一步了解RGO對(duì)白腐菌褪色染料的影響，設(shè)計(jì)了無(wú)白腐菌降解條件下RGO對(duì)染料的吸附作用探究實(shí)驗(yàn).將40 ml液體培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的RGO(0～4.0 mg/mL)，并用乙酸調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH值至5.0，高壓滅菌后向體系中加入1 mL濃度為30 mg/L的活性艷紅染液，37℃恒溫黑暗震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100 rpm.每隔12小時(shí)從體系中取出2 mL染色培養(yǎng)液，高速離心后取上清液，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)染料在538 nm處的吸光度，分析染料褪色情況.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為4個(gè)單獨(dú)數(shù)據(jù)的平均值，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯著性差異，p＜0.05表示有顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 還原石墨烯的表征

測(cè)試RGO的影響之前，對(duì)制備出的RGO做了一系列的詳細(xì)表征，以確保樣品質(zhì)量.圖2為RGO透射電鏡圖像，從圖2可以看出RGO是典型的片層結(jié)構(gòu)，且有輕微的褶皺堆疊現(xiàn)象.

圖2 RGO的透射電鏡圖像Fig.2 TEM image of RGO

通過(guò)XPS分析其元素含量，其中碳元素含量大約占73.6%，氮元素大約占0.7%，氧元素大約占25.7%.通過(guò)將C1s XPS進(jìn)行分峰處理如圖3所示，碳原子化學(xué)鍵主要有三個(gè)成分，即 C-C(56.6%)，C-O(39.5%)和C＝O(3.9%).其殘余氧原子以含氧官能團(tuán)的形式存在，紅外光譜證實(shí)了該材料有許多的含氧基團(tuán).圖4為RGO紅外譜圖，約3 467 cm-1處的寬峰表明存在-OH/-COOH基團(tuán)，1 070 cm-1處的峰表明存在C-O基團(tuán)，在1 616 cm-1處是典型的C ＝C信號(hào).此外，在紅外光譜中沒有觀察到VC的典型吸收峰，說(shuō)明VC被清洗去除的很干凈.總的來(lái)說(shuō)，表征結(jié)果說(shuō)明，RGO樣品制備成功，且不含重金屬或抗壞血酸雜質(zhì)，適用于毒性評(píng)價(jià).

圖3 RGO的C1s X射線光電子能譜圖Fig.3 C1s XPS spectrum of RGO

圖4 RGO的紅外光譜圖像Fig.4 IR spectrum of RGO

2.2 還原石墨烯對(duì)白腐菌降解活性艷紅X-3B的影響

將白腐菌曝露于不同濃度的RGO中培養(yǎng)，觀測(cè)RGO對(duì)白腐菌褪色染料活性艷紅的影響.圖5為白腐菌褪色染料后的濕重干重圖像.由圖5a可以看出，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，白腐菌濕重隨體系中RGO濃度的增加而增加，與沒有RGO存在的對(duì)照組相比，增加趨勢(shì)有顯著性差異(p＜0.05).由圖5b可以看出，與濕重趨勢(shì)不同的是，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，白腐菌干重隨體系中RGO濃度的增加而減小，當(dāng)RGO濃度達(dá)到4.0 mg/mL時(shí)，有顯著性差異(p＜0.05).RGO濃度的增加導(dǎo)致濕重和干重趨勢(shì)不同，推測(cè)是由于RGO與染料產(chǎn)生的毒性使得白腐菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致白腐菌中毒水腫，因此濕重有增加趨勢(shì).數(shù)據(jù)說(shuō)明RGO對(duì)白腐菌降解染料過(guò)程有影響，RGO導(dǎo)致白腐菌在體系中水腫，且抑制白腐菌的生長(zhǎng)，高濃度的RGO影響下對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用更明顯.

圖5 RGO對(duì)白腐菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Influence of RGO on the weight gain of P.chrysosporium.

對(duì)白腐菌褪色染料后的體系pH值進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)褪色后的體系pH值較培養(yǎng)前均有顯著性增加(p＜0.05)，但沒有超出白腐菌培養(yǎng)的最適宜pH值范圍(4.5～5.5).這是由于白腐菌自身的調(diào)節(jié)作用，沒有RGO存在的對(duì)照組pH值增加，說(shuō)明白腐菌生長(zhǎng)和降解染料的過(guò)程對(duì)體系pH值有影響，其分泌代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)了環(huán)境pH值.同時(shí)有RGO存在的實(shí)驗(yàn)組中，體系pH值變化與對(duì)照組相當(dāng)，說(shuō)明RGO對(duì)體系pH值影響不大(圖6).

圖6 RGO對(duì)體系pH值的影響Fig.6 Influence of RGO on the pH value of culture system

對(duì)白腐菌降解染料的脫色情況進(jìn)行定時(shí)測(cè)定，每12 h測(cè)定一次染液吸光度變化，并繪制脫色曲線如圖7所示.數(shù)據(jù)顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在72 h左右都基本脫色完全.無(wú)RGO的對(duì)照組脫色速率比有RGO的體系慢，且體系中的RGO濃度越高，脫色速率越快，脫色完全所需時(shí)間越短.當(dāng)RGO濃度為4.0 mg/mL時(shí)，體系在12 h就已經(jīng)基本脫色完全.數(shù)據(jù)說(shuō)明無(wú)RGO影響下白腐菌可以徹底降解染料，體系基本褪色完全，而RGO的引入有利于白腐菌脫色染料，RGO濃度越高，染料脫色速率越快.

圖7 RGO對(duì)白腐菌降解活性艷紅X-3B的影響Fig.7 Influence of RGO on the decomposition activity of P.chrysosporium for reactive brilliant red X-3B

由于RGO是多孔的片層結(jié)構(gòu)，其本身就是良好的吸附性材料，因此上述實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組對(duì)染料的脫色完全依靠于白腐菌的降解作用，而實(shí)驗(yàn)組對(duì)染料的脫色則來(lái)自于兩部分貢獻(xiàn)，一部分是白腐菌的降解，而另一部分來(lái)自于RGO的吸附作用.為了進(jìn)一步了解RGO在白腐菌降解染料過(guò)程中的影響，設(shè)計(jì)了在無(wú)白腐菌降解的情況下測(cè)定RGO對(duì)染料的吸附作用實(shí)驗(yàn)，并繪制了脫色曲線如圖8所示.

圖8 RGO對(duì)活性艷紅X-3B的吸附作用影響Fig.8 Influence of RGO on sorption for reactive brilliant red X-3B

對(duì)照組為無(wú)白腐菌和RGO作用的染液吸光度，相同培養(yǎng)條件下染液吸光度基本不變，染液無(wú)褪色現(xiàn)象.隨著體系RGO濃度的增加，染液脫色速率增加，脫色率也增加.RGO的吸附主要集中在0～12 h，所以0～12 h脫色速率最快，隨著RGO的吸附位點(diǎn)逐漸被填滿，脫色速率也逐漸減慢，最終達(dá)到吸附平衡.與圖7相比較，相同條件下脫色等量染料，降解作用比吸附作用耗時(shí)更長(zhǎng).只有吸附作用影響時(shí)，高濃度RGO能使得染料完全褪色，而低濃度RGO只能褪色部分染料.

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究RGO對(duì)白腐菌降解活性艷紅X-3B的影響過(guò)程，發(fā)現(xiàn)RGO對(duì)白腐菌的生長(zhǎng)有影響.RGO的引入導(dǎo)致白腐菌中毒水腫，濕重呈顯著性增加.RGO濃度越大，白腐菌水腫程度也越大.同時(shí)白腐菌干重呈明顯的下降趨勢(shì)，說(shuō)明RGO在白腐菌降解染料過(guò)程中抑制了其生長(zhǎng)，當(dāng)RGO濃度增大到4.0 mg/mL時(shí)，白腐菌干重減少有顯著性差異.對(duì)褪色前后體系pH值進(jìn)行了測(cè)定，褪色后的體系pH值均有顯著性的增加，但仍在白腐菌培養(yǎng)的最適pH范圍內(nèi)，這是由于白腐菌生長(zhǎng)及脫色染料過(guò)程中自身分泌的代謝產(chǎn)物對(duì)環(huán)境pH值進(jìn)行了調(diào)節(jié).有或無(wú)RGO影響下的體系pH值變化相當(dāng)，說(shuō)明RGO對(duì)白腐菌降解染料過(guò)程的pH值影響不大.因此在使用白腐菌生物降解法治理污水中的染料時(shí)，應(yīng)盡量避免高濃度RGO的存在，減少RGO對(duì)白腐菌生長(zhǎng)的影響，同時(shí)需要注意調(diào)節(jié)體系pH值在白腐菌生長(zhǎng)的適宜pH范圍內(nèi).

對(duì)染液吸光度變化進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)白腐菌能夠充分徹底的降解染料，但耗時(shí)較長(zhǎng)，而加入RGO可以加快染料褪色，RGO濃度越大，褪色效率越高.而RGO因其獨(dú)特的多孔片層結(jié)構(gòu)，本身對(duì)染料具有一定的吸附作用，RGO濃度越高，其對(duì)染料的吸附量越大，吸附作用時(shí)間也比降解作用耗時(shí)更短.低濃度RGO只能部分吸附染料，若要徹底脫色染料需要加大RGO濃度，或者引入白腐菌進(jìn)行降解作用.在污水治理中，可以用RGO吸附染料，但需要大量RGO才能保證脫色完全，不如生物降解法環(huán)保經(jīng)濟(jì).而使用白腐菌生物降解法雖可以徹底降解染料，但耗時(shí)長(zhǎng)、效率低.綜上所述，在生物治理污水中的染料時(shí)，可以適量引入低濃度的RGO，在確保白腐菌生長(zhǎng)的條件下，加快染料脫色速率.

3 結(jié)論

在染料脫色過(guò)程中，RGO對(duì)白腐菌的毒性主要體現(xiàn)在白腐菌鮮重增加、干重減少，但是對(duì)環(huán)境pH幾乎無(wú)影響.白腐菌降解染料的過(guò)程可以受到RGO刺激而加速，其貢獻(xiàn)包括白腐菌的降解作用和石墨烯的吸附作用.還原態(tài)的石墨烯對(duì)白腐菌處理污水的影響較小，具有較高的環(huán)境生物安全性.

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