山羊乳餅中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良乳酸菌的初步篩選

馬青雯，王馨聆，王昱敬，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201）

0 引言

乳酸菌廣泛存在于自然界中，是國際公認(rèn)的食品安全級微生物（GRAS）[1]。乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮良好的作用與乳酸菌自身的性能有關(guān)，除了在腸道內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量之外，對腸胃環(huán)境中高酸度、膽鹽、膽汁、胰酶等具有一定的耐受性才能順利達(dá)到腸胃內(nèi)部實(shí)現(xiàn)定殖[2]。

乳餅是是云南三大傳統(tǒng)乳制品之一，至今已有600多年歷史[3]。經(jīng)過長期的自然馴化，乳餅及乳清中富含的乳酸菌及其生物學(xué)特性得到了很好的保存。楊希良，王昱敬[4]，楊玉森[5]等對乳餅中的乳酸菌進(jìn)行了研究，但至今關(guān)于乳餅中優(yōu)良乳酸菌的篩選鮮有報道。本研究旨在對云南大理地區(qū)傳統(tǒng)乳餅中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并篩選特性優(yōu)良的乳酸菌，為云南地區(qū)益生特性優(yōu)良乳酸菌的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

（1）菌種和細(xì)胞：鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusrhamnosus，LGG）為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)中心保藏；人腸上皮細(xì)胞HT-29購自中國科學(xué)院昆明動物研究所。

（2）試劑：MRS培養(yǎng)基，M 17培養(yǎng)基，RPM I-1640培養(yǎng)基，PBS緩沖液，改良型RPM I-1640培養(yǎng)基，胰酶，0.1%的T riton-X 100，0.4%臺盼藍(lán)，胎牛血清（Fetalbovine serum,FBS-Standard）。

（3）儀器：倒置顯微鏡（AE200），澳柯瑪超低溫冰箱（DW-86L390），紫外可見分光光度計（A360），二氧化碳培養(yǎng)箱（1PH-460），尼康光學(xué)顯微鏡（E200），生物安全柜（HF-safe-1200LC）。

2 方法

2.1 樣品的采集

6份山羊乳餅樣品采集自云南省大理市白族地區(qū)，采樣地點(diǎn)如表1所示。嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行樣品的采集。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后放入4℃冰箱中保藏[7]。

表1 山羊乳餅采樣地點(diǎn)

2.2 乳酸菌的分離鑒定

2.2.1 乳酸菌的分離、純化與初步鑒定

將樣品進(jìn)行研磨后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水中進(jìn)行10倍梯度稀釋，采用傾注法培養(yǎng)微生物[8]。根據(jù)菌落形態(tài)特征，劃線分離純化3次后挑取單菌落于M RS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)及培養(yǎng)液pH值測定，確定純種，革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性的菌株置于-80℃的超低溫冰箱中保藏。

2.2.2 乳酸菌16S rRNA序列鑒定

將分離純化后的乳酸菌用16S rRNA基因序列分析法進(jìn)行鑒定，其中DNA的提取使用DNA提取試劑盒，PCR方法參照文獻(xiàn)[6]。PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行的雙向測序，得到序列后利用SeqM an軟件進(jìn)行序列拼接，獲得約1 500 bp的有效序列[9-10]，登陸 NCBI（www.ncbi.n lm.gov/blast/）網(wǎng)站，進(jìn)行同源性分析和序列比對。

2.3 益生菌株的篩選

2.3.1 耐酸性實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11]配制人工胃液。將分離鑒定得到的乳酸菌進(jìn)行活化，取傳至第3代菌株按體積分?jǐn)?shù)5%,分別接種于pH值為6.2，3.5，3，2.5的模擬胃液中,以pH值為6.2的模擬胃液為對照組，于37℃下恒溫培養(yǎng)。在培養(yǎng)0和2 h[12]后稀釋涂板，用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，根據(jù)活菌數(shù)判定乳酸菌的耐酸情況。

存活率計算公式：存活率=（處理組活菌數(shù)/對照組活菌數(shù)）×100%。

2.3.2 小腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

模擬小腸液的配制參照文獻(xiàn)[13]中方法。取傳至第3代菌株按體積分?jǐn)?shù)5%分別接種于小腸液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，0.30%，0.50%的MRS液體培養(yǎng)基中；于37℃下恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)0 h和6 h后稀釋涂板，利用平板計數(shù)法測定實(shí)驗(yàn)菌株活菌數(shù)。

2.3.3 黏附實(shí)驗(yàn)

HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[14]；活菌數(shù)的測定參照文獻(xiàn)[15]。

黏附實(shí)驗(yàn)：參考K im[16]的實(shí)驗(yàn)方法稍加改變。采用PBS緩沖液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇適宜的3個梯度涂板，每個處理作3個平行，38℃培養(yǎng)48 h后計算平均每個細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)，并與參考菌株鼠李糖桿菌（LGG）比較。

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的分離鑒定

3.1.1 分離菌株的理化特性

6份樣品中分離的46株乳酸菌的理化特性如表2所示。

由表2可以看出：在6份樣品中分離出46株菌，46株菌革蘭氏染色均呈陽性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)46株菌均呈陰性。46株菌的培養(yǎng)液pH值最低為4.17，pH值最高為4.68。由菌株形態(tài)學(xué)特征和理化特性可鑒定出46株疑似乳酸菌?？鼔翡鬧17]從20份成熟酸菜樣品中分離出12株乳酸菌，王昱敬[18]從9份傳統(tǒng)乳扇樣品中分離出32株乳酸菌，張振宇[19]從3份傳統(tǒng)傣家酸魚中分離到10株菌，本研究結(jié)果與以上報道相似。

3.1.2 乳酸菌16S rRNA序列鑒定結(jié)果

46株疑似乳酸菌的16S rRNA序列鑒定結(jié)果如表3所示。

6份大理羊乳餅樣品中分離出的46株乳酸菌，通過16S r RNA基因序列對比，有3個屬：腸球菌（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）、鏈球菌（Streptococcus），6個種：馬腸鏈球菌（Streptococcusequi）、屎腸球菌（Enterococcus faecium）、解沒食子酸鏈球菌（Streptococcusgallolyticus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。其中菌株DLR 4-5-4與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcus faecium同源性為99%故被鑒定為屎腸球菌，其他45株菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株同源性為100%。此外乳球菌的分離率遠(yuǎn)高于乳桿菌，乳球菌分離率為97.83%，其中腸球菌占71.74%，屎腸球菌占46.67%，馬腸鏈球菌占19.56%。這可能是因?yàn)槭耗c球菌是兼性厭氧的乳酸菌，和大多數(shù)乳酸菌一樣，其耐酸耐高溫等抗逆性能力差，但是對于嚴(yán)格厭氧、培養(yǎng)和保存條件苛刻的乳酸菌而言屎腸球菌更易于生長，同時大理地區(qū)氣候溫和，氣候類型為低緯度高原季風(fēng)氣候，四季溫差小[20-21]為屎腸球菌的生長提供了基礎(chǔ)。

3.2 益生菌株的篩選結(jié)果

3.2.1 耐酸性能

用分離鑒定得到的46株菌在模擬胃液中進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

乳酸菌具有良好的耐酸性是保障其順利進(jìn)入胃腸道的先決條件。人體的胃部是一個高酸度的環(huán)境，pH值在1.5到4.0之間，成年人pH值約為2.0，在空腹條件下為1.5[7]，進(jìn)食后胃液pH值被稀釋，pH值上升至3.5左右[22]。食物通過胃的時間較短，一般為1～2 h，故選擇在2 h后進(jìn)行活菌數(shù)的測定[7]。由表4可知，46株分離純化菌株在4個pH值下培養(yǎng)2 h后顯示出不同的活菌數(shù)。46株菌在pH值為6.2的條件下活菌數(shù)均在105～106m L-1之間，說明菌株活力較好，適合進(jìn)行耐酸實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過酸處理菌株DLR 1-1-4，DLR 2-1-2，DLR 3-2-4，DLR 3-3-3，DLR 4-7-4，DLR 6-12-2在pH值為3.5的條件下活菌數(shù)≥107m L-1；其中菌株 DLR 1-1-4，DLR 2-1-2，DLR 3-3-3，DLR 4-7-4在pH值為3.5和3的條件下活菌數(shù)≥107m L-1，這表明此4株菌具有更優(yōu)的耐酸性，能在高濃度的胃液中存活并進(jìn)入小腸。

表2 分離菌株的理化特性

表3 從乳餅樣品中分離鑒定的乳酸菌

3.2.2 小腸耐受性

選取pH值在2.5～3.5條件下活菌數(shù)在105～106m L-1之間的12株菌模擬小腸液進(jìn)行小腸耐受實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。

人體小腸中膽汁鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%～0.3%之間波動[23]，乳酸菌在小腸液中活菌數(shù)高則表明乳酸菌對小腸液有良好的耐受能力。常人進(jìn)食后食物在小腸內(nèi)停留的時間大致為6～8 h[24-25]，故選擇在6 h后測定活菌數(shù)。由表5可知，0 h時12株菌的活菌數(shù)均≥105m L-1。6 h后在濃度為0.10%與0.15%的模擬小腸液中菌株DLR 3-2-4及DLR 6-12-2活菌數(shù)均≥107m L-1，此外在0.10%，0.1.5%，0.30%的小腸濃度中，菌株DLR 1-1-4，DLR 3-2-4，DLR 3-3-3，DLR 3-5-3，DLR 4-7-4，DLR 6-12-2活力較好，活菌數(shù)均在105m L-1以上，這表明6株菌對模擬小腸液有良好的耐受性能在小腸內(nèi)存活。

表4 乳酸菌對酸的耐受性

表5 乳酸菌對小腸耐受性

3.2.3 黏附性

選取模擬小腸液3個濃度下活菌數(shù)≥105m L-1的6株菌進(jìn)行體外黏附實(shí)驗(yàn)。由于鼠李糖乳桿菌（LGG）黏附能力較強(qiáng)[26-27]，故用LGG作為對比，結(jié)果如表6所示。

表6 乳酸菌黏附細(xì)胞數(shù) m L-1

乳酸菌能通過胃腸嚴(yán)苛的環(huán)境并能在小腸壁上黏附是乳酸菌定植和大量繁殖的前提,故乳酸菌在宿主細(xì)胞上黏附能力的強(qiáng)弱是衡量乳酸菌益身功能的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。由表6可知，2 h后菌株DLR 6-12-2和LGG與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)與0 h時比無顯著差異，2 h后其他乳酸菌與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量與0 h時比差異顯著。2 h后菌株DLR 6-12-2與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量與對比菌株LGG無顯著差異；其他菌株與對比菌株LGG相比差異顯著，其中菌株DLR 1-1-4和DLR 4-7-4與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量比LGG低，其他菌株與細(xì)胞黏附的活菌數(shù)量比LGG高。此外6株菌對人腸上皮細(xì)胞HT-29均表現(xiàn)出不同程度的黏附，DLR 1-1-4黏附率為 2.69%，低于其他菌株；菌株DLR 3-2-4，、DLR 4-7-4,DLR 6-12-2的黏附率較高，黏附率分別達(dá)到16.33%，15.72%,18.16%均高于LGG黏附率，這表明菌株DLR 3-2-4，，DLR 4-7-4,DLR 6-12-2能在胃腸道內(nèi)定殖。

4 結(jié)論

6份大理羊乳餅樣品中分離出的46株乳酸菌，通過16S r RNA基因序列對比，有3個屬，6個種，其中屎腸球菌為優(yōu)勢菌。通過耐酸及耐小腸液實(shí)驗(yàn)從46株乳酸菌中篩選出6株對強(qiáng)酸及膽汁都具有良好的耐受性的乳酸菌，活菌數(shù)較高，能保證一定數(shù)量的菌體通過環(huán)境嚴(yán)苛的胃腸道；通過黏附性實(shí)驗(yàn)得到菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DLR 4-7-4黏附性優(yōu)于參考菌株LGG。耐受性實(shí)驗(yàn)及黏附性實(shí)驗(yàn)表明菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DR 4-7-4不僅能通過胃腸道并能在胃腸道內(nèi)定殖；因而菌株DLR 3-2-4，DLR 6-12-2，DLR 4-7-4優(yōu)良乳酸菌。

參考文獻(xiàn)：

[1]錢洋.乳酸菌對食品中常見霉菌的抑制和黃曲霉素的去除[D].山東大學(xué),2012.

[2]O'SHEAE F,GARDINERG E,O'CONNOR PM,etal.Characterization of enterocin-and salivaricin-producing lactic acid bacteria from the mammalian gastrointestinal tract[J].Fems M icrobiology Letters,2009,291(1):24.

[3]肖蓉,徐昆龍,侯艷,等.乳餅保鮮方法的探討[J].中國乳品工業(yè),2007,35(9):17-20.

[4]王昱敬,楊海秀,劉雪英,等.山羊乳餅中乳酸菌的多樣性研究[J].中國乳品工業(yè),2016,44(9):20-23.

[5]楊玉森,潘紅梅,殷建忠,等.云南撒尼地區(qū)乳餅及酸乳清中優(yōu)良乳酸菌的篩選和發(fā)酵性能研究[J].現(xiàn)代食品科技,2015(11).

[6]BERGER T.Sampling of milk and dairy products[J].Agrarforschung,2006.

[7]楊吉霞,陳芝蘭,楊海燕,等.牦牛奶酪中乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵性能分析[J].食品科學(xué),2013,34(9):198-204.

[8]李琳琳,王雅婷,楊欣,等.豬源乳酸菌的分離及其生物學(xué)性能研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版,2016,44(2):1-7.

[9]夏雪娟,陳芝蘭,陳宗道,等.16S rDNA序列分析法快速鑒定西藏地區(qū)傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌[J].食品科學(xué),2013,34(14):245-249.

[10]WU R,WA NG L P,MENGHE B,et al.Isolation and preliminary probiotic selection of Lactobacilli from koumiss in Inner Mongolia[J].Journal of Basic Microbiology,2009,49(3):318-326

[11]C.PEDERSEN,H.JONSSON,J.E.LINDBERG,S.Roos.Microbiological Characterization of Wet Wheat Distillers'Grain,with Focus on Isolation of Lac to bacilli with Potential as Probiotics[J].Applied&Environmental Microbiology,2004,70(3):1522.

[12]石月鋒.對新疆少數(shù)民族自制酸奶樣品進(jìn)行乳酸菌的分離、篩選及中試實(shí)驗(yàn)研究[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[13]邵鑫.人體胃腸道微生態(tài)消化模擬系統(tǒng)的構(gòu)建及其穩(wěn)定性評估[D].暨南大學(xué),2016.

[14]王泳.嗜酸乳桿菌分泌的胞外蛋白調(diào)控HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞生長機(jī)制的研究[J].食品科學(xué),2016.

[15]楊帆,李淑梅,陳萍,等.發(fā)酵過程中菌液濃度的檢測[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2009,26(6):1643-1645.

[16]KIM P I,JUNG M Y,CHANG Y H,et al.Probiotic properties of Lactobacillusand Bifidobacterium strainsisolated from porcine gastrointestinal tract.[J].Applied M icrobiology and Biotechnology,2007,74(5):1103-1111.

[17]奎夢漪,薛橋麗,康嬌,等.云南自然發(fā)酵酸菜液中乳酸菌的分離鑒定及其發(fā)酵性能研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(8):107-109.

[18]王昱敬,李偉葉,張瀟俊,等.傳統(tǒng)乳扇中乳酸菌的多樣性研究[J].食品科技,2017(1):12-18.

[19]張振宇,李忠孝,袁明龍,等.傣家酸魚中乳酸菌的分離鑒定及乳酸發(fā)酵的初步研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(11):41-45.

[20]楊金濤.大理蒼山氣候與旅游資源的分析研究[J].民營科技,2010(7):148-148.

[21]楊澄,付志嘉,趙曉紅.1971-2010年云南大理大風(fēng)天氣特征統(tǒng)計及分析[C].中國氣象學(xué)會年會.2012.

[22]鄒多武,許國銘.靜脈滴注潘妥拉唑?qū)】党扇?4小時胃內(nèi)pH變化的影響[J].中華消化雜志,2001,21(3):159-161.

[23]SNB SP,M ILLER R B,HOWE LL K,et al.Physicochem ical propertiesof dietary phytochem icals can predict their passive absorption in the human small intestine.[J].Scientific Reports,2017,7.

[24]PISLAR M,BRELIH H,MRHAR A,et al.Analysisof small intestinal transitand colon arrival timesof non-disintegrating tabletsadm inistered in the fasted state[J].European Journal of Pharmaceutical SciencesO fficial Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences,2015,75:131-41.

[25]劉秀其,何劍平,陳根林,等.慢性重型肝炎頑固性腹脹的病理生理意義[J].傳染病信息,2003(1):13-13.

[26]MANDAL H,JARIWA LA R,BAGCHIT.Isolation and characterization of lac to bacilli from human faeces and indigenous fermented foods for their potential application as probiotics[J].Canadian Journal of Microbiology,2015,62(4):1-11.

[27]ATARASH I,KOJI,TANOUE,et al.Th17 Cell Induction by Adhesion of M icrobes to Intestinal Epithelial Cells[J].Cell,2015,163(2):367.