牦牛乳RNA的完整性及其硬脂酰去飽和酶（SCD1）基因表達分析

張嘉齊，羅毅皓，孫萬成

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)系，西寧810016）

0 引言

RNA通常是從組織、全血和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取獲得[1]。高質(zhì)量且完整的總RNA是進行后續(xù)分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵步驟[2-4]。但RNA的單鏈結(jié)構(gòu)使其極易發(fā)生降解[5-7]。RNA的濃度、純度、完整性是評價RNA質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)[8]。RNA的純度是通過測定RNA在260 nm及280 nm下的吸光值來確定[9-10]，RNA的完整性可利用瓊脂糖凝膠電泳[11-12]、實時定量PCR[13-15]和RNA完整數(shù)值（RNA Integrity N umber，R IN）進行評價。牦牛乳中豐富的蛋白質(zhì)和脂肪[16-18]，會給總RNA的分離純化及后續(xù)分子試驗帶來較大困難，但Izum i等[19]通過定量PCR檢測到m RNA以一個相對高水平存在于牛乳中，并且還可抵抗工業(yè)加工，在嬰兒配方乳粉中少量存在。。因此本試驗以牦牛乳為試驗原料，研究不同的處理及加工對牦牛乳中RNA純度及完整性的影響，為在從分子水平上對牦牛乳及牦牛乳制品進行研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗

1.1 材料與試劑

2016年4～9月和2017年4月，從牧民家中采集牦牛乳，早晨手動收集牦牛牛乳為研究樣本，牦牛乳的樣本采集量約為300m L。采集結(jié)束之后，將收集的牦牛乳分裝在50 m L Rnase-Free離心管中，用冰袋包裹后及時送到實驗室存放在-20℃的冰箱中。

RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量染料（SYBR G reen II），DL1000 DNA Marker，瓊脂糖，RN ase Free dH2O，核酸染料（4s R ed Plus Nucleic Acid Stain），2×Taq Master Mix（Dye Plus），牦牛硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD 1）引物由大連寶生物工程有限公司合成。如表1所示。

表1 牦牛SCD 1基因cDNA克隆引物

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機（2－16KL），PCR儀（PCR System 9700），電泳儀（JY 600），凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR＋），熒光定量儀（CFX 96）。

1.3 牦牛乳的不同處理

（1）對新鮮牦牛乳進行不同溫度的加熱處理，即40，50，60，70，80，90℃加熱30 m in，提取牦牛乳總RNA，檢測純度及完整性。

（2）將2016年4月、5月、6月、7月、8月、9月采集的新鮮牦牛乳置于-20℃冰箱中冷凍至2017年4月，將牦牛乳解凍后提取總RNA，檢測純度及完整性。

（3）對牦牛乳進行不同形式的加工，將新鮮牦牛乳預(yù)凍[20]30 m in后置于真空冷凍干燥機中，溫度為-60℃，100 kPa冷凍干燥12 h后提取牦牛乳凍干粉總RNA檢測純度及完整性，將牦牛乳凍干粉保存于-20℃；將新鮮牦牛乳加工成乳酪后，提取牦牛乳酪總RNA檢測純度及完整性，將牦牛乳酪保存于-80℃。

1.4 總RNA的提取

對于-20℃凍存的牦牛乳，取出后應(yīng)立即放于37℃的水浴鍋中加熱至完全溶解后取500μL進行總RNA的提??；真空冷凍干燥的牦牛乳凍干粉，取30 m g進行總RNA的提取；牦牛乳酪應(yīng)取300m g進行總RNA的提取。

向離心管中加入350μL Bu ffer R L，震蕩后室溫靜置2 m in；將裂解液轉(zhuǎn)移到gDNA Eraser Spin Colum n中，14 800 r/m in離心2 m in；取濾液加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，混勻后立即將混合液全部轉(zhuǎn)入到 RNA Spin Co lum n中，12 000 r/m in離心1 m in，棄濾液；加入500μL Buffer RWA ，12 000 rpm離心30 s，棄濾液；加入600μL Buffer RWB，12 000 rpm離心30 s，棄濾液；加入50μL DN ase I，室溫靜置15 m in；加入600μL Buffer RWB ，12 000 rpm離心30 s，棄濾液；將RNA Spin Co lum n重新安置于2 m L Co llection Tube上，12 000 rpm離心2m in，棄濾液；在RNA Spin Colum n膜中央加入20μL RN ase Free dH2O，室溫靜置5 m in，12 000 r/m in離心2 m in洗脫RNA。

提取出的RNA可立即使用或?qū)⑵滟A存于-80℃的冰箱中備用。

1.5 RNA質(zhì)量濃度和純度的測定

取1μL提取的總RNA，用超微量分光光度計測其濃度及OD 260/OD 280的值。純度較高的RNA的OD 260/OD 280值應(yīng)該介于1.8～2.0之間[21]。

1.6 RNA完整性的分析

取10μL提取到的牦牛乳總RNA與2μL 6×Loading Bu ffer混合，點樣于1%的瓊脂糖凝膠于150 V電泳20 m in，凝膠成像系統(tǒng)觀察其完整性。

1.7 RT-PCR分析

RT-PCR對cDNA的純度和質(zhì)量都有較高的要求，為了驗證提取牦牛乳RNA的效果，進行RT-PCR驗證。

（1）cDNA第一條鏈的合成。以牦牛乳中提取的Total RNA為模板，按試劑盒推薦方法進行操作，將所有液體離心混勻后放置于PCR儀上，在37℃（15 m in），85℃5s條件下反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于-20℃。如表2所示。

（2）PCR擴增。對反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進行PCR擴增。擴增程序為94℃預(yù)變性5 m in；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，從第二步開始進行33個循環(huán)；72℃延伸7 m in。取4μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。RT-PCR擴增產(chǎn)物保存于-20℃。如表2所示。

表2 RT-PCR反應(yīng)液

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下加熱總RNA的質(zhì)量濃度和純度變化

不同溫度下加熱30m in后牦牛乳中總RNA的提取結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，隨著處理溫度的逐漸升高，牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度逐漸降低，80℃和90℃處理的牦牛乳中總RNA的純度較其它溫度有明顯降低。不同溫度下處理的牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度和純度都存在顯著差異，其中70℃和80℃處理的牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度沒有顯著差異，新鮮牦牛乳和60℃、70℃處理的牦牛乳中總RNA的純度沒有顯著差異。

2.2 不同月份采集的牦牛乳總RNA的質(zhì)量濃度和純度變化

2016年不同月份采集的牦牛乳分別保存不同的時間后提取的總RNA結(jié)果如表4所示。由表4可以看出，-20℃分別保存360，330，300，270，240，210 d后的牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度和純度與新鮮牛乳都存在顯著差異。

表3 不同溫度加熱30m in后牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度和純度

表4 2016年不同月份采集經(jīng)保存后的牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度和純度

2.3 不同加工形式總RNA的質(zhì)量濃度和純度

不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的提取結(jié)果如表5所示。由表5可以看出，與新鮮未處理的牦牛乳相比，牦牛乳凍干粉與牦牛乳酪的總RNA質(zhì)量濃度濃度大幅度下降，分別下降了24.45 ng/μL和22.9 ng/μL，純度分別下降了0.27和0.25。不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的質(zhì)量濃度和純度都存在顯著差異，其中牦牛乳干粉和牦牛乳酪中總RNA的質(zhì)量濃度和純度沒有顯著差異。

表5 不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的質(zhì)量濃度和純度

2.4 不同的處理方式總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

不同的處理方式及加工形式后提取牦牛乳中總RNA，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在溫度為40，50，60，70，80，90℃時，對牦牛乳加熱30 m in后提取的牦牛乳中總RNA未見其RNA的電泳條帶；2016年4，5，6，7，8，9月采集的牦牛乳保存至2017年4月后提取的牦牛乳中總RNA未見其RNA的電泳條帶；不同的加工形式即牦牛乳凍干粉和牦牛乳酪中總RNA也未跑出RNA的電泳條帶，與之前的研究結(jié)果保持一致[16]。

2.5 不同溫度下加熱后牦牛乳中總RNA的RT-PCR

以不同溫度處理的牦牛乳中總RNA為模板，對基因SCD 1進行RT-PCR擴增后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳顯示，40，50，60，70℃加熱30 m in的牦牛乳中SCD 1基因在181 bp處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，且條帶清晰整齊，能滿足對牦牛乳中基因進行表達量研究的需要。80℃和90℃加熱30m in后的牦牛乳中SCD 1基因條帶暗，不能滿足對牦牛乳中基因表達研究的需要。

圖1 不同溫度下加熱30min后牦牛乳中SCD1基因的RT-PCR

2.6 不同月份采集的牦牛乳中總RNA的RT-PCR

以2016年不同月份采集并保存一定時間的牦牛乳總RNA模板，對基因SCD 1進行RT-PCR擴增后電泳顯示，不同月份采集且保存不同時間的牦牛乳SCD 1基因在181 bp處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，且條帶清晰整齊。牦牛乳在-20℃保存了長達一年后，還可以滿足對牦牛乳中基因進行表達分析的需要。

圖2 2016年不同月份采集的牦牛乳保存一定時間后牦牛乳中SCD 1基因的RT-PCR

2.7 不同加工形式的牦牛乳制品中總RNA的RT-PCR

對牦牛乳進行不同形式的加工后以牦牛乳制品中的總RNA為模板，對基因SCD 1基因進行擴增后跑電泳，牦牛乳凍干粉SCD 1基因在181 bp處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，且條帶清晰整齊，可以滿足對牦牛乳中基因進行表達量分析的需要。但牦牛乳酪SCD 1基因條帶暗，不能滿足對牦牛乳中基因表達研究的需要。

2.8 Agilent 2100檢測牦牛奶凍干粉RNA的完整性

利用Agilent 2100，檢測放置于-20℃冰箱保存一年的牦牛奶凍干粉的RNA完整性，結(jié)果如圖4。通常認(rèn)為，R IN值＞7的標(biāo)本適用于高質(zhì)量的RNA研究，如基因芯片檢測；R IN值為4～7時，可以用于一般的分子生物學(xué)研究，如RT-PCR；當(dāng)R IN＜4時，會嚴(yán)重影響分子生物學(xué)的試驗結(jié)果[22]。-20℃保存了一年的牦牛奶凍干粉中RNA的R IN值為6.3且在18/28s位

圖3 不同加工形式的牦牛乳制品中SCD1基因的RT-PCR

圖4 牦牛奶凍干粉的RNA完整性檢測

置出現(xiàn)明顯的峰，可用于進行后續(xù)的基因定量測定。

結(jié)果表明：不同的處理方式及加工形式會對牦牛乳中的rRNA產(chǎn)生影響，但m RNA會比較穩(wěn)定的存在，有研究發(fā)現(xiàn)部分m RNA存在于外泌體中[23]，外泌體 能 夠攜 帶 微小 RNA（m icroRNAs，m iRNAs)，RNA，蛋白質(zhì)等生物活性分子，并保護其免遭降解[24-25]，牦牛乳中的m RNA可以穩(wěn)定存在，可能是由于外泌體的保護。由于cDNA文庫構(gòu)建、基因克隆和基因表達分析等許多后續(xù)分子生物學(xué)操作都需要完整的m RNA[26]，因此可以利用牦牛乳及乳制品中的m RNA進行后續(xù)的基因研究，解決了采集牛乳腺組織和肝臟樣品費時費力的問題，有利于牦牛動物福利，是一種較好的非浸染方法。并且通過設(shè)計特異常性引物，進行PCR擴增可以鑒別牦牛乳的摻假[27]，為牦牛乳的摻假檢測提供新的思路。

3 結(jié)論

研究了牦牛乳不同的處理方式及加工形式對其總RNA的純度及完整性的影響，在40，50，60，70，80，90℃加熱30 m in后會對牦牛乳中總RNA的質(zhì)量濃度與純度產(chǎn)生一定的影響；2016年4～9月采集的牦牛乳保存至2017年4月后對牦牛乳中的總RNA的質(zhì)量濃度與純度都有一定的影響；牦牛乳凍干粉和牦牛乳酪中的總RNA的質(zhì)量濃度和純度較新鮮牦牛乳相比都有大幅度下降。

對上述不同的處理方式及加工形式提取出的牦牛乳中總RNA跑電泳時發(fā)現(xiàn)，所有的處理方式及加工形式均未見其RNA的電泳條帶，但在對提取的總RNA進行SCD 1基因的RT-PCR時，溫度為40，50，60，70℃加熱30m in后的牦牛乳，2016年不同月份采集的牦牛乳并保存一定時間后的牦牛乳，以及牦牛乳凍干粉的SCD 1基因均跑出了條帶，條帶清晰整齊，滿足了對牦牛乳進行后續(xù)基因研究的需要。并且對-20℃保存了一年的牦牛奶凍干粉中RNA的完整性檢測，發(fā)現(xiàn)RNA仍滿足后續(xù)對牦牛乳基因表達研究的要求。

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