紅松松針原料超聲波輔助提取生物抑菌劑的研究

武天琦，張欣，張智*，張曉華

(1.東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省輕工科學研究院，哈爾濱 150010；3.牡丹江市食品藥品檢測中心)

紅松松針是紅松(Pinuskoraiensis)的葉。紅松松針具有再生速度快、分布范圍廣、天然儲量大、可持續(xù)利用的特點[1]。松針利用歷史悠久，《本草綱目》記載：“松針氣味苦、溫、無毒，主治風濕痔瘡，生毛發(fā)、安五臟、守中、不饑荒年”[2]，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱等臨床藥理作用[3]和增強免疫力、降血脂、抗衰老、抗疲勞及抗氧化等多種保健功能[4-5]，此外，松針還有較強的的抑菌[6]能力，但研究較少。本文應用響應面方法，采用大腸桿菌抑菌效果為指標，優(yōu)化了超聲波輔助工藝對紅松松針抑菌物質(zhì)提取的條件，為開發(fā)紅松松針為原料的抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紅松松針采集于東北林業(yè)大學。大腸桿菌為東北林業(yè)大學食品微生物實驗室保存。

1.2 儀器

中藥粉碎機；電熱恒溫干燥箱；電子分析天平；旋轉蒸發(fā)儀；pH計；滅菌鍋；無菌操作臺；恒溫振蕩器；恒溫培養(yǎng)箱；超聲波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理。將紅松松針洗凈后，放置于干燥箱中烘干，用中藥粉碎機粉碎并過60目篩，用1∶40石油醚浸泡24h脫去粗脂肪，烘干后備用。

1.3.2 抑菌圈的測定。將提取液旋轉蒸發(fā)去除溶劑后定容至50mL。采用濾紙片擴散法測定抑菌圈的大小，向90mm培養(yǎng)皿中倒入20mL已滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后，加入100μL菌液，涂布均勻，靜置5min。濾紙片打成直徑6mm的圓片，滅菌。將含有10μL提取液的的濾紙片置于培養(yǎng)皿表面。培養(yǎng)皿于37℃培養(yǎng)24h，用游標卡尺測量抑菌圈大小[7]。

1.3.3 抑菌活性單因素試驗。抑菌活性測定單因素試驗包括乙醇濃度、料液比、超聲時間、提取溫度，乙醇濃度(A)：40%、50%、60%、70%、80%，料液比(B)：20、30、40、50、60mL/g，超聲時間(C)：10、20、30、40、50min，提取溫度(D)：30、40、50、60、70℃。每個因素進行3次重復試驗，選用平均值作為參數(shù)，確定各因素對結果的影響。

表1 紅松松針提取物對大腸桿菌抑菌活性單因素試驗表

1.3.4 抑菌活性響應面試驗。在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Design-Expert 8.0軟件，Box-Behnken設計響應面試驗，并用SAS9.0統(tǒng)計分析軟件對4因素3水平的響應面結果進行分析。試驗因素水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對抑菌效果的影響。由圖1可知，提取液中乙醇含量從40%逐漸增加時，析出的松針抑菌物質(zhì)量也逐漸增多，抑菌圈直徑顯示出增大現(xiàn)象；而乙醇濃度為50%是一個臨界條件，再繼續(xù)增大，抑菌圈直徑降低。

圖1 乙醇濃度對松針抑菌物質(zhì)提取的影響

2.1.2 料液比對抑菌效果的影響。由圖2可知，料液比依次增大，抑菌圈直徑先增大最后平穩(wěn)略下降。橫坐標的料液比為50mL/g時，縱坐標的抑菌圈直徑最大，為9.12mm。當料液比達到50mL/g時，松針抑菌物溶出量達到頂峰，不再溶出，抑菌圈直徑呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)。

圖2 料液比對松針抑菌物質(zhì)提取的影響

2.1.3 超聲時間對抑菌效果的影響。由圖3可知，超聲時間增加，抑菌圈直徑先增大后減小。當為30min時，抑菌圈直徑最大，為9.24mm。

圖3 超聲時間對松針抑菌物質(zhì)提取的影響

2.1.4 提取溫度對抑菌效果的影響。由圖4可知，提取溫度增加，抑菌圈直徑先增大后減小。當為50℃時，抑菌圈直徑最大，為9.11mm。提取溫度50℃是一個臨界條件。

圖4 提取溫度對松針抑菌物質(zhì)提取的影響

2.2 響應面試驗

表3 響應面設計及試驗結果

根據(jù)表2安排試驗，對試驗結果回歸擬合所得回歸模型如下：y=9.75+0.065×A+0.32×B+0.24×C+0.16×D-0.048×A+0.088×A×C+0.056×A×D+0.14×B×C+0.097×B×D-0.057×C×D-0.58×A2-0.30×B2-0.72×C2-0.64×D2

由表3、4可知，失擬項P=0.6317>0.05，表明模型與實際值之間具有較好的擬合度；模型的P<0.0001,說明模型具有極高的顯著度；模型的決定系數(shù)R2=0.9032，AdjR2=0.8129，說明預測值與實測值之間具有較好的擬合度，表明模型的可靠性高。

表4 響應面二次模型方差分析

由圖5可知，影響紅松松針抑菌物對大腸桿菌抑菌效果的因素順序為：B>C>D>A，即影響最大的是料液比，其次是提取時間。此回歸模型的最優(yōu)結果為乙醇濃度50.55%，料液比56.05mL/g，超聲時間32.19min,提取溫度51.60℃，在此條件下對應的響應值R的最大值為9.89mm，即最大的抑菌圈直徑為9.89mm?？紤]儀器設備及相關條件，確定最優(yōu)工藝參數(shù)值為乙醇濃度50%，料液比56mL/g，超聲時間30min,提取溫度50℃，在此工藝條件進行3次平行試驗，得到的抑菌圈大小為(9.78±0.14)mm。

3 結果與討論

本試驗研究超聲波輔助對紅松松針抑菌物進行提取，運用了濾紙片法測定大腸桿菌抑菌圈大小作為研究指標，并用響應面法進行了優(yōu)化。經(jīng)過綜合考慮后最佳工藝條件為乙醇濃度50%，料液比56mL/g，超聲時間30min,提取溫度50℃。試驗結果表明，適宜提取條件下，紅松松針抑菌物對大腸桿菌具有良好的抑菌活性，其作為植物源抑菌劑可能具有良好的開發(fā)前景，但其抑菌活性成分還有待進一步的研究。

圖5 兩因素交互作用對紅松松針抑菌物質(zhì)提取效果影響的響應面圖

[1]12 MEI J，CHEN P，PENG P.PCDD/Fs accumulation in pine needles:variation with species and pine needle age[J].Environmental Science & Pollution Research，2016，23(01):563-570.

[2]李時珍.本草綱目(下冊)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1982:1917.

[3]李萍，劉友平.松針研究進展[J].成都中醫(yī)藥大學學報，2001，24(03):49-50.

[4]YOU-LAN H E，LIU A Q，TIGABU M，et al.Physiological responses of needles of Pinus massoniana elite families to phosphorus stress in acid soil[J].林業(yè)研究(英文版) ，2013，24(02):325-332.

[5]WANG J Y，SHU L I，YANG X F，et al.Resistance Activities to Pathogenic Bacteria and Composition Analysis of Cedrus deodara Needle Extracts[J].Lishizhen Medicine & Materia Medica Research，2015.

[6]黃順東.松針臨床應用及藥理研究概況[J].實用中醫(yī)藥雜志，2005，21(08):514-515.

[7]LV F，LIANG H，YUAN Q，et al.In vitro antimicrobial effects and mechanism of action of selected plant essential oil combinations against four food-related microorganisms[J].Food Research International，2011，44(09):3057-3064.