miR-34a調(diào)控MSR1蛋白對前列腺癌細胞遷移和侵襲的影響*

韓興濤 楊凌博 魏澎濤 李小輝 孫建濤 楊錦建

(洛陽市中心醫(yī)院泌尿外科，洛陽 471000)

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的原發(fā)性腫瘤，發(fā)病率為 8/10萬，大約占所有泌外系統(tǒng)所有腫瘤類型的18%[1]。目前主要的治療方案是手術或手術后化療，然而，即便有手術機會，術后患者的平均生存期只有為5～6個月。且復發(fā)率也相對較高[2]。隨著前列腺癌發(fā)病相關基因和對分子機制認識的進展，尋求調(diào)控前列腺癌的分子已經(jīng)成為腫瘤治療和改善預后的新方向。MicroRNA(miRNA)是一種保守的非編碼的小RNA，其可以調(diào)節(jié)基因和蛋白質(zhì)的表達。通過結(jié)合mRNA下游的相關蛋白調(diào)控其降解或翻譯過程[3,4]。miRNA可調(diào)節(jié)多種腫瘤的生物學行為，包括細胞分化和增殖，以及遷移過程[5,6]。最近新出現(xiàn)的研究證據(jù)表明，miRNA在前列腺癌細胞自我更新和分化中負調(diào)節(jié)某些蛋白表達，進而促進其行為。最近，發(fā)現(xiàn)了miR-34可以作為腫瘤抑制劑在前列腺癌中有潛在作用，但是其具體機制尚未研究明確[7]。

巨噬細胞清道夫受體1(MSR1)基因定位在16q23，可以編碼下游相關轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在腫瘤細胞的基因序列中[8]。MSR1作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以和蛋白修飾酶結(jié)合形成復合物，通過與啟動子結(jié)合，調(diào)控細胞分化和器官形成過程。到目前為止，一些研究結(jié)果證實MSR1在乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表達上升，而且在乳腺癌、前列腺癌中已經(jīng)證實MSR1與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關[9]。

在前列腺癌中，miR-34a和MSR1相互關系的研究鮮有報道。本研究闡明miR-34a和MSR1在前列腺癌中表達作用及相應作用機制，對前列腺癌的診斷和治療具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1細胞株與主要試劑 人前列腺癌細胞LNCap、PC3、DU145和22RV1購買自上海細胞研究所。細胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的1640RPMI培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。MSR1兔單克隆抗體購自Abcam(ab123946)。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。miR-34a-mimic和LV5-MSR1慢病毒購自上海吉凱基因有限公司。

1.2方法

1.2.1qPCR 熒光定量PCR檢測miR-34a、MSR1的表達 用Trozel(Gibco) 抽提前列腺癌細胞的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄擴增miR-34a和MSR1，MSR1用GAPDH作為內(nèi)參物，miR-34a使用U6作為內(nèi)參。反應條件：以200 ng總RNA為模版，通過逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，在37℃中孵育15 min，然后在95℃中退火5 min。后根據(jù)Kapa PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數(shù)據(jù)以公式RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。

1.2.2Western blot檢測MSR1蛋白水平 按照說明書配制10%SDS-PAGE分離膠，每孔加入20 μg蛋白樣品。使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，TBST充分沖洗后，使用1∶1 000稀釋一抗孵育(兔單克隆MSR1抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記羊抗兔IgG(1∶2 500) 稀釋，室溫孵育2 h；ECL顯影后檢測。實驗重復3次。

1.2.3雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?從人類基因組DNA產(chǎn)生全長MSR1-3′UTR，并通過退火合成的信號寡核苷酸產(chǎn)生突變體MSR1-3′UTR。將這些DNA片段克隆到ph-TK載體(腎臟熒光素酶)中，preporter-MSR1-3′UTR代表野生型質(zhì)粒載體和miR-133結(jié)合共轉(zhuǎn)染，preporter-MSR1-3′UTRm代表突變型質(zhì)粒載體和miR-133結(jié)合共轉(zhuǎn)染，同時使用pGL-3.0(熒光素酶)作為內(nèi)參照，檢測NC組和miR-34a-mimic組中MSR1的熒光活性相對值。根據(jù)制造商試劑說明書使用Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒(Promega)測量螢火蟲和海腎熒光素酶活性，通過雙熒光素酶檢測miR-34a對MSR1的表達活性的調(diào)控能力。

1.2.4Transwell侵襲實驗檢測前列腺癌細胞的侵襲能力 所有試劑及器材均于冰塊上預冷處理，將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠100 μl，37℃孵育20 min，膠凝固后進行細胞操作；逐步消化、離心、計數(shù)細胞后，按照2.5×104ml-1濃度用無血清培養(yǎng)基將前列腺癌細胞稀釋，制成細胞懸液；按照每孔200 μl的細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養(yǎng)基500 μl，放入37℃孵箱培養(yǎng)；孵育24 h后使用甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色15 min，使用棉簽去除小室內(nèi)膜上的細胞，然后于顯微鏡下計數(shù)，觀察4個高倍視野下(×40)穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.2.5劃痕實驗檢測前列腺癌細胞的遷移能力 劃痕實驗：將前列腺癌細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200 μl消毒槍頭垂直劃線，并在顯微鏡下測量劃痕的初始距離(0 time)，然會孵育24 h、48 h、72 h后，分別測量劃痕的距離，并計算細胞的遷移率。實驗重復3次。細胞遷移率的計算公式=[遷移距離D(0 h)-遷移距離D(24 h、48 h、72 h)]/ 遷移距離D(0 h)。

2 結(jié)果

2.1miR-34a和MSR1在人前列腺癌細胞株中的表達情況 如圖1A所示，MSR1在前列腺癌細胞株中呈現(xiàn)表達不一的水平，我們選取MSR1蛋白水平相對較高的前列腺癌細胞株PC3，用于后續(xù)試驗過表達MSR1的實驗。如圖1B顯示，miR-34a的表達水平在不同類型的前列腺癌細胞株中表達水平不同，miR-34a在PC3中表達情況相對較低，因此，選取PC3細胞株作為本實驗的實驗細胞株。

2.2雙熒光素酶檢測miR-34a和MSR1相關關系 我們通過TargetScan生物信息網(wǎng)站檢測MSR1是miR-34a的下游相關靶標，通過雙熒光素酶試驗檢測MSR1和miR-34a在前列腺癌細胞中的相互表達關系。我們發(fā)現(xiàn)miR-34a具有和MSR1相似的3′-UTR結(jié)合序列。轉(zhuǎn)染miR-34a-mimic后檢測miR-34a的表達水平相對增高(圖2A)。然后將MSR1 3′-UTR克隆到miRNA報告載體中。miR-34a的過表達熒光素酶活性降低到對照組的70%水平，表明miR-34a可以有效抑制MSR1的熒光活性。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示(圖2B)：miR-34a-mimic可以明顯抑制MSR1的熒光素酶活性。表明miR-34a能與MSR1的3′UTR特異性結(jié)合，并可以調(diào)控MSR1的表達活性。

圖1 miR-34a 和MSR1 在人前列腺癌細胞株中的表達情況Fig.1 Expression of miR-34a and MSR1 in human prost-ate cancer cell linesNote: A.Expression of MSR1 in prostate cancer cell lines;B.miR-34a expression in prostate cancer cell lines.

圖2 雙熒光素酶實驗檢測miR-34和MSR1之間的相互關系Fig.2 Dual luciferase assay examines the correlation between miR-34 and MSR1Note: A.Effect of miR-34a-mimic on miR-34a expression；B.Double luciferase assay to detect the effect of miR-34a on the activity of MSR1.*.P<0.05.

2.3miR-34的表達對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響 為了研究miR-34a對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響。使用PC3細胞株進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染以增加miR-34a的表達。通過Transwell侵襲實驗檢測miR-34a對PC3細胞侵襲情況的影響。如圖3A所示，miR-34a-mimic組的細胞侵襲數(shù)目比對照組明顯降低[(186.1±12.5) vs (89.3±8.2),P=0.021]，差異具有統(tǒng)計學意義。通過劃痕愈合實驗檢測miR-34a對PC3細胞遷移情況的影響。如圖3B所示，miR-34a-mimic組的細胞遷移速度比其對照組明顯減慢[24 h (0.38±0.02) vs (0.18±0.03),P=0.015;48 h (0.82±0.11) vs (0.51±0.08),P=0.009;72 h (1.25±0.19) vs (0.82±0.12),P=0.016]，差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果說明，miR-34a過表達后可以明顯抑制PC3細胞的遷移和侵襲能力。

2.4MSR1的表達對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的逆轉(zhuǎn)作用 為了研究MSR1的表達對miR-34a影響前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的逆轉(zhuǎn)作用。使用Transwell侵襲實驗檢測MSR1對PC3細胞侵襲能力逆轉(zhuǎn)的影響。如圖4A所示，miR-34a-mimic+LV5-MSR1組的細胞侵襲數(shù)目比miR-34a-mimic組明顯增多[(192.1±11.4) vs (75.8±7.1),P=0.035]， 差異具有統(tǒng)計學意義。通過劃痕愈合實驗檢測MSR1對PC3細胞遷移情況的影響。如圖4B所示，miR-34a-mimic+LV5-MSR1組的細胞遷移速度比miR-34a-mimic組明顯增快[24 h (0.38±0.02) vs (0.18±0.03),P=0.015;48 h (0.82±0.11) vs (0.51±0.08),P=0.009;72 h (1.25±0.19) vs (0.82±0.12),P=0.016]，差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果說明，過表達MSR1后可以明顯逆轉(zhuǎn)miR-34a對前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

圖3 miR-34 的表達對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of miR-34 expression on ability of prostate cancer cells to migrate and invadeNote: A.Transwell invasion test to detect the effect of miR-34a on invasive ability of prostate cancer cells;B.Scratch healing test to detect the effect of miR-34a on the migration of prostate cancer cells.*.P<0.05.

圖4 MSR1 的表達對前列腺癌細胞遷移和侵襲能力的逆轉(zhuǎn)作用Fig.4 Reversal of MSR1 expression on ability of prostate cancer cells to migrate and invadeNote: A.Transwell invasion test to detect the reversal effect of MSR1 on invasive ability of prostate cancer cells;B.Scratch healing test to detect the effect of MSR1 on the migration of prostate cancer cells.*.P<0.05.

3 討論

前列腺癌目前在發(fā)展中國家發(fā)病率很高，相比發(fā)達國家來說，其發(fā)病率及死亡率都更高[10]。目前有研究報道，電離輻射、生活習慣(吸煙史等)和遺傳易感性都是前列腺癌的主要病因和高危因素[11]。晚期的前列腺癌對周圍組織侵襲情況比較嚴重，對周圍組織的浸潤和破壞是引起癥狀的主要原因，只能依靠手術切除治療，往往也只能起到緩解作用，但是術后復發(fā)相當嚴重[12]。所以進一步研究前列腺癌的分子機制和疾病進展有利于改善前列腺癌的診斷和預后。

最近很多研究都報道m(xù)iRNA在多種惡性腫瘤中充當很重要的調(diào)控作用[13]。通常來說，miRNA扮演腫瘤抑制因子的角色，通過下調(diào)促癌基因的表達或者促進抑癌基因的表達來實現(xiàn)抑制腫瘤的作用。同時有研究表明，miRNA可以同時調(diào)節(jié)多種信號通路，參與多種途徑的信號傳導[14]。在遺傳性前列腺癌中，部分miRNA存在異常表達的現(xiàn)象，比如miR-14、miR-29、miR-573等[15,16]。miRNA的異常表達可以上調(diào)或者下調(diào)前列腺癌中的轉(zhuǎn)錄分子，影響前列腺癌細胞的增殖、分化以及凋亡等行為。miR-34a在多種類型的腫瘤組織中表達異常，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等，miR-34a的表達失調(diào)能夠改變腫瘤細胞的遷移和侵襲等惡性生物學行為。Dong等[17]在人卵巢癌細胞中發(fā)現(xiàn)miR-34a通過調(diào)節(jié)EMT達到抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。但是miR-34a在前列腺癌中的表達以及調(diào)控機制尚未有研究報道。

MSR1基因位于8p22，可以編碼A 型巨噬細胞清道夫受體蛋白[18]?？梢越閷Ь奘杉毎け砻婢哂型淌晒δ艿淖R別受體的表達，進而介導炎癥的產(chǎn)生，影響細胞的部分生物學行為。最近研究顯示，MSR1基因與前列腺癌、卵巢癌以及動脈粥樣硬化等多種疾病有一定的相關性[19]。白立剛等[20]研究表明，在亞洲人群中MSR1基因的突變與前列腺癌的遺傳易感性相關。而目前，在臨床還沒有完全明確MSR1在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的具體機制，尤其是其上下游相關調(diào)控的miRNA的表達情況。

本研究通過檢測前列腺癌中miR-34a和MSR1的表達情況及相關關系，抑制miR-34a后前列腺癌細胞的生物學行為的變化，再次探討MSR1對前列腺癌細胞生物學行為的逆轉(zhuǎn)作用。我們研究結(jié)果顯示，過表達miR-34后，前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力受到相應的抑制，這表明miR-34a可以有效抑制前列腺癌細胞的惡性生物學行為；而之后過表達MSR1后前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力得到逆轉(zhuǎn)，表明MSR1可以和miR-34a相互調(diào)控對前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力進行干擾。

綜上所述，前列腺癌中miR-34a的表達可以通過靶向調(diào)控MSR1影響前列腺癌細胞的遷移和侵襲能力，MSR1的過量表達可以逆轉(zhuǎn)miR-34a在前列腺癌中的抑制能力，表明miR-34a和MSR1在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演一個關鍵作用，可能成為前列腺癌的一個新的預防和治療靶點，有效改善前列腺癌的診斷和預后情況。

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