聚肌胞苷酸及地塞米松誘導的胸腺萎縮及胸腺RLR信號通路表達的比較研究*

劉 洋 陳 頌 龔盛強 葛金文 朱惠斌

(湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 421001)

胸腺作為機體內(nèi)重要的免疫器官，為遷入胸腺的前體細胞提供基質(zhì)微環(huán)境，指導其增殖、分化成為功能成熟的T淋巴細胞。同時，在人類/猴免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus or simian immunodeficiency virus ,HIV/SIV)[1]、流感病毒[2]等多種病毒感染后，胸腺可發(fā)生萎縮及功能受損，影響T細胞的分化、成熟、遷移以及免疫記憶形成，進而影響整個免疫系統(tǒng)行使正常功能——如通過阻止記憶型CD8+T細胞分化導致中樞免疫耐受[3]。病毒感染后期，胸腺功能損傷還是免疫重建失敗的主要機制[4]。因此，研究胸腺功能損傷的機制和調(diào)節(jié)機制，可促進病毒感染導致胸腺受損的治療策略和藥物的研發(fā)。

胸腺萎縮動物模型是研究胸腺功能受損的重要工具。目前國內(nèi)較多采用糖皮質(zhì)激素誘導模型，其機制可能與損傷線粒體、誘導胸腺細胞凋亡有關[5]；表現(xiàn)為自由基的產(chǎn)生、ATP的減少和線粒體抗氧化防御機制啟動；以及細胞色素C依賴的Caspase-9、Caspase-3活化并導致凋亡。近年來研究報道采用聚肌胞苷酸Poly(I∶C)也可誘導胸腺萎縮[6]。Poly(I∶C)是一種病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)，可部分模擬病毒感染的免疫激活機制。它阻止胸腺細胞從雙陰性DN1/DN2階段往DN3/DN4階段發(fā)育。有意思的是，Poly(I∶C)不僅是TLR-3的特異激活劑，也可激活視黃酸誘導基因1樣受體家族(Retinoic-acid-inducible gene Ⅰ like receptors,RLRs)信號通路；文獻顯示Poly(I∶C)誘導胸腺萎縮的作用依賴于RLR家族[6]。

RLR是一類能識別胞質(zhì)病毒RNA的模式識別受體，可誘導干擾素和促炎癥細胞因子的產(chǎn)生,在抗病毒天然免疫中起著非常重要的作用。該家族包含三個成員：RIG-Ⅰ、黑色素瘤分化相關抗原5(Melanoma differentiation associated gene 5 ,MDA5)以及生理學實驗室蛋白2(Laboratory of genetics and physiology 2,LGP2)，其中RIG-Ⅰ和MDA5在識別胞質(zhì)中病毒RNA后，與線粒體外膜的銜接蛋白分子MAVS結合，啟動兩條信號途徑：一是通過活化NF-κB激活促炎癥細胞因子基因；二是使干擾素調(diào)節(jié)因子IRF-3和IRF-7磷酸化，轉(zhuǎn)位后激活Ⅰ型干擾素基因，產(chǎn)生抗病毒效應。此外，RIG-Ⅰ還可激活炎癥小體NLRP3并導致IL-1β活化[7]。

根據(jù)上述研究報道推測，Poly(I∶C)誘導胸腺萎縮可能通過RLR信號，更接近病毒感染；而DEX的機制可能為直接誘導胸腺細胞凋亡，但缺乏二者的直接比較數(shù)據(jù)。因此，本研究比較了二者誘導小鼠胸腺萎縮模型的異同及其RLR的改變情況，為在研究病毒感染導致胸腺受損的機制中選擇合適的動物模型提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性C57BL/6小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物中心，SPF級動物房飼養(yǎng)。動物許可證號： SCXK-(湘)2015-0003。

1.1.2主要試劑與儀器 Poly(I∶C)(貨號：Tllrl-pic-5)購自InvivoGen公司；地塞米松注射液購自湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，無水乙醇、PBS粉劑、異丙醇、三氯甲烷購自廣州化學試劑廠；TRIzol Reagent購自 Life Technologies 公司(貨號： 15596026)；Primescript RT reagent kit with Gdna Eraser 酶，SYBR Premix EX TaqTMⅡ酶(貨號：RR820A，RR047A)購自寶生物TaKaRa公司;全血基因組DNA提取試劑盒購自天根公司(貨號DP318)；T 細胞受體重排刪除環(huán)(T cell receptor rearrangementexcision circles，TREC)、β-actin、RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2、MAVS、IFNα、IFNβ引物由Primerbank查找，都經(jīng)過Blast匹對，由華大基因有限公司合成。兔抗小鼠RIG-1(貨號：A0545-1ML)購自Cell signaling;兔抗小鼠Actin(貨號：A5316)購自美國Sigma公司；二抗：辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(貨號：#32460)購自美國Thermo Scientific；ECL化學發(fā)光顯色液購自BIO-RAD公司；SuperSignal West FemtoTrial Kit(貨號：#34094)購自美國Thermo Scientific。流式抗體Mouse Na?ve/Memory T cell Panel(貨號：561609)購于 BD 公司。CFX96 TouchTM實時熒光定量PCR儀為美國BIO-RAD；BHB生物攝影顯微鏡為日本奧林巴斯；AEL-160型電子天平為日本島津；流式細胞儀為美國BD FACSCantoⅡ。

1.2方法

1.2.1小鼠胸腺萎縮模型的建立 隨機將24只雄性小鼠均分為3組，分別為DEX注射處理組，Poly(I∶C)注射處理組以及正常對照組，每組8只。 DEX注射處理組用 DEX 腹腔注射(20 mg/kg)誘發(fā)小鼠胸腺應激性萎縮，隔天1次，共注射2次。Poly(I∶C)注射處理組實驗前將Poly(I∶C)粉劑用滅菌生理鹽水溶解(1 mg/ml)，用于腹腔注射，隔天1次，每次0.2 ml，共注射3次。正常對照組給予等量生理鹽水腹腔注射，同為隔天注射。實驗期間各組小鼠可自由攝食和飲水。

1.2.2胸腺指數(shù)測定 各組小鼠均在末次注射24 h 后，稱取小鼠體質(zhì)量，小鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，取胸腺檢測。沿小鼠胸部正中線兩側(cè)打開胸腔，將胸骨上翻，充分暴露位于胸骨上段后的乳白色胸腺，從根部完整剝離，分離胸腺周邊的結締組織和脂肪后，用濾紙吸取血液，在分析天平上稱取質(zhì)量，按照公式計算胸腺指數(shù)。

1.2.3病理組織學觀察 留取一側(cè)胸腺，置于4%甲醛溶液中固定24 h后，常規(guī)75%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片(4 μm)，蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察組織的病理改變。

1.2.4外周血T細胞亞群檢測 末次注射24 h后，各組小鼠心臟采血100 μl，使用EDTA抗凝管采集，每100 μl外周血加入相應抗體5 μl， 常溫避光孵育30 min，加入2 ml溶血素常溫避光靜置30 min，去除紅細胞， PBS清洗1遍，重懸制備成單細胞懸液后，上流式細胞儀檢測。分析時，依次選取淋巴細胞群體、CD3+CD4+T細胞群體，根據(jù)CD62L和CD44的表達，將CD4細胞分為效應型(CD44+CD62L-)、中央記憶型(CD44+CD62L+)和初始型(CD44-CD62L+)三個亞群。

1.2.5胸腺TREC檢測 末次注射24 h后，小鼠心臟采血200 μl，EDTA抗凝后，使用DNA抽提試劑盒，按照試劑盒說明步驟提取血液總DNA，通過紫外分光光度計測定DNA純度和濃度，將制備好的DNA加入已混有引物的熒光反應液中，進行 PCR 擴增。 反應結束后， 確認實時熒光定量 PCR 的擴增曲線和溶解曲線，得出各試驗孔的 Ct 值，并以同一樣本中β-actin 的 Ct 值作為內(nèi)參。引物序列：TREC正向5′-GAAGCTGACAGGGCAGGTTT-3′，反向5′-TGAGCATGGGCAAGCAGTACC-3′；β-actin：正向5′-GAAATCGTGCGTGATCAAAG-3′， 反向5′-TGTAG-TTTCATGCCACAG-3′。 反應條件預變性，95℃、10 min，1個循環(huán)；熱循環(huán)，95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環(huán)擴增。

1.2.6RLR/MAVS通路相關基因表達情況 將其取出的另一側(cè)胸腺，放入液氮罐，取出后往組織內(nèi)加入Trizol研磨，提取總RNA，使用Primescript RT reagent kit with Gdna Eraser 酶試劑盒，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為Real-time PCR的樣本模板，利用SYBR Premix EX TaqTM酶試劑盒，配置含有目標引物的反應液，置于熒光定量PCR 儀擴增。反應條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。RLR/MAVS通路相關基因引物序列為：RIG-Ⅰ：正向5′-CCACCTACATCCTCAGCTACATGA-3′，反向5′-TGGGCCCTTGTT-GTTCTTCT-3′；MDA5：正向5′-AGATCAACACCTGTGGTAACACC-3′，反向5′-CTCTAGGGCCTCCACGAACA-3′；LGP2：正向 5′-GAGACCTGGAACCATCA-3′，反向5′-CCCTCGAGGTGTTTCCAGTA-3′；MAVS正向5′-AGACACCAAGTTGCCCCAAG-3′，反向5′-CTGGA-AGGAAACGGTTGGAGA-3′； Ifna正向5′-GACCTCCACCAGCAGCTCAA-3′，反向5′-ACCCCCACCTGC-TGCAT-3′；Ifnb正向5′-GACGTGGGAGATGTCCTC-AAC-3′，反向5′-GGTACCTTTGCACCCTCCAGTA-3′。 定量PCR的循環(huán)溫度條件:為 95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán);并繼續(xù)以65℃到95℃的溶解曲線以確認無明顯非特異性擴增。

1.2.7RLR/MAVS通路相關蛋白表達情況 根據(jù)基因表達情況，提取胸腺蛋白，BCA法定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜。5%牛血清白蛋白室溫封閉3 h，加入適當濃度的一抗4℃孵育過夜，再置于1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色、掃描，記錄下來的照片通過使用Image J軟件進行光密度分析。計算時采用RIG-Ⅰ與β-actin的光密度比值的相對表達量

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1小鼠胸腺的外觀及胸腺指數(shù)變化 與正常對照組相比，DEX處理組、Poly(I∶C)處理組小鼠胸腺均呈現(xiàn)不同程度的萎縮，DEX處理組的萎縮程度更明顯(圖1A)，以胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)計算胸腺指數(shù)，兩組均顯著低于正常對照組(P<0.05)(圖1B)。表明Poly(I∶C)和DEX均導致胸腺萎縮；DEX組更為嚴重。

2.2小鼠病理組織學改變 HE染色后觀察，可見正常對照組小鼠的胸腺組織結構清晰，皮質(zhì)髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)區(qū)淋巴細胞排列整齊、密集，髓質(zhì)區(qū)可見胸腺小體。Poly(I∶C)組胸腺髓質(zhì)變多(圖2短箭頭所示)，皮髓分界線不明顯，單核巨噬細胞增多。DEX組皮質(zhì)變薄，胸腺細胞數(shù)量明顯減少(圖2長箭頭所示)，疏松散在，見大量網(wǎng)狀上皮細胞；有的細胞胞漿內(nèi)有空泡形成。可見Poly(I∶C)和DEX誘導的胸腺病理改變特點的差異非常明顯,DEX對胸腺皮質(zhì)的破壞更為明顯。

2.3小鼠外周血TREC的定量PCR測定及流式檢測初始CD4亞群 定量PCR檢測外周血T細胞受體重排刪除環(huán)(TREC)的表達水平，計算其相對于管家基因β-actin的倍數(shù)、判斷胸腺輸出功能。結果顯示，Poly(I∶C)組和DEX組的TREC與正常對照組相比較，減少均非常顯著(P<0.01)。而兩組之間比較，Poly(I∶C)組的TREC減少更為明顯，但差異無統(tǒng)計學意義(圖3A)。

圖1 各組小鼠的胸腺外觀及胸腺指數(shù)Fig.1 Thymus and thymus index in each groupNote: A.The appearance of each group of mouse thymus,From the left to the right were normal group,Poly (I∶C) treatment group,DEX treatment group；B.Thymus index chart.**.P<0.01.

圖2 各組胸腺的組織形態(tài)學Fig.2 Histomorphology of thymus in each groupNote: HE staining of the thyrnustissue,A-C.×100;D-F.×400.

進一步通過流式細胞儀對小鼠外周血CD4比例以及初始/記憶CD4亞群比例的檢測發(fā)現(xiàn)，Poly(I∶C)導致外周血總CD4以及初始型CD4比例增高，而DEX組的CD4比例略為下降、但無統(tǒng)計學意義；各亞群比例改變不明顯。

與DEX相比較，Poly(I∶C)導致的TREC減少有更為嚴重的趨勢，但外周血總CD4比例以及初始型CD4比例增高，提示Poly(I∶C)可能有促進胸腺外初始型CD4增殖的作用。

2.4RLR/MAVS通路相關基因表達情況 與正常對照組相比較，DEX組的RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2 mRNA的表達均顯著上調(diào)(P<0.01)，IFN-α/β mRNA的表達也顯著升高(P<0.05)。而Poly(I∶C)組這些基因(除IFN-β外)的表達水平雖然略高于正常對照組，但無統(tǒng)計學意義；顯著低于DEX組。各組之間MAVS、IL-1β mRNA的差異并不明顯(圖4)。

2.5RLR/MAVS通路相關蛋白表達情況 由于DEX刺激后RLR家族的RIG-Ⅰ、MDA-5和LGP2 mRNA均上調(diào)，我們選擇了較有代表性的RIG-Ⅰ進行Western blot驗證。結果顯示，與管家基因β-Actin相比較，DEX刺激后RIG-Ⅰ蛋白的含量明顯增高；Poly(I∶C)刺激后也略有增高、但與正常對照組比較差異并不顯著(圖5)。

圖3 外周血TREC和CD4亞群的檢測Fig.3 Detection of TREC and CD4 subgroups in peripheral bloodNote: A.The expression of TREC gene in peripheral blood of mice in each group;B.The flow cytometry of CD4 group in normal group；C.The expression of CD4 T cells in lymphocytes of each group；D.Flow chart of CD4 subgroups.*.P<0.05，**.P<0.01.

圖4 胸腺RLR/MAVS/IFN-α/β及IL-1β基因表達的改變Fig.4 Changes of RLR/MAVS/IFN-α/β and IL-1β gene expression in thymusNote: *.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 胸腺RIG-Ⅰ蛋白水平的檢測Fig.5 Detection of thymus RIG-Ⅰ protein levelsNote: *.P<0.01.

3 討論

胸腺是T細胞發(fā)育、分化和成熟的重要場所，在其中發(fā)生的事件涉及到抗感染免疫、自身免疫與免疫耐受、免疫重建等重要課題[4]。因此，深入探討病毒感染導致胸腺萎縮及胸腺功能受損的機制及調(diào)節(jié)機制，有可能研發(fā)出新的治療靶點及藥物。

胸腺萎縮動物模型是研究胸腺功能損傷的重要工具。目前國內(nèi)常采用腎上腺糖皮質(zhì)激素(如地塞米松)誘導產(chǎn)生胸腺萎縮模型，其機制可能為誘導CD4+CD8+雙陽性(DP)胸腺細胞凋亡，導致強烈的胸腺細胞消耗——糖皮質(zhì)激素受體信號在胸腺細胞的選擇和凋亡中起著重要的調(diào)控作用[8]，并導致許多基因反式激活或抑制[9,10]。然而，該模型可能與病毒感染導致的胸腺萎縮存在較大差異。還是以HIV/SIV病毒感染為例，如果采用DEX誘導的胸腺萎縮模型來進行研究，存在以下問題：① HIV/SIV感染損傷胸腺功能的機制可能包括：HIV病毒直接感染破壞胸腺細胞、病毒蛋白誘導細胞凋亡[11]、天然免疫系統(tǒng)的激活、炎癥及膠原沉著等。顯然，糖皮質(zhì)激素誘導胸腺萎縮有可能代表了HIV/SIV感染導致胸腺細胞凋亡的部分機制[11]，但并不全面。②DEX誘導了胸腺的嚴重萎縮和破壞，而文獻中SIV誘導的胸腺萎縮程度并不嚴重[2]，我們推測此差異可能是因為DEX導致的胸腺細胞凋亡遠比SIV感染劇烈。③曾有研究采用糖皮質(zhì)激素治療HIV感染，在較長時間內(nèi)維持了免疫系統(tǒng)不被破壞[12]；這也提示糖皮質(zhì)激素可以對抗HIV感染導致免疫破壞的一些機制，如抗炎。因此，必須采用其他模型、才能比較全面地模擬HIV/SIV感染導致的胸腺損傷和進行相應藥物的研發(fā)。

文獻報道聚肌胞苷酸Poly(I∶C)通過MDA5相關的途徑引起的胸腺快速萎縮[6]，為我們提供了一個重要的工具。MDA5識別高度保守的病原體相關分子模式，如dsRNA，從而啟動下游的MAVS分子，進而分泌趨化因子和細胞因子，誘導干擾素的表達。有意思的是，多項研究表明在HIV/SIV感染中，Ⅰ型干擾素參與了胸腺萎縮、胸腺細胞發(fā)育受損的形成[13,14]。近期的研究更直接證實Ⅰ型干擾素參與了后期T細胞的胸腺內(nèi)成熟[15]。據(jù)此，我們推測RLR(RIG-Ⅰ/MDA5)-IFN-α/β通路可能在病毒感染介導的胸腺萎縮和胸腺功能損傷中起到重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，DEX和Poly(I∶C)兩種造模方法都能使胸腺退化及輸出減少；而Poly(I∶C)在胸腺的病理損傷以及初始型CD4+T細胞亞群改變上更接近SIV感染。但是，DEX明顯上調(diào)了RIG-1、MDA5、LGP2及下游的IFNα/β mRNA；而文獻[6]顯示MDA5介導Poly(I∶C)引起的胸腺萎縮，因此，我們推測MDA5可能也介導了DEX誘導的胸腺萎縮。跟文獻報道不一致的地方在于，本研究Poly(I∶C)造模方法中MDA5-Ⅰ型IFN通路雖然也有一定程度的上調(diào)、但差異并不明顯。我們推測，是因為該文獻采用的是MDA5基因敲除小鼠，而我們研究的是DEX和Poly(I∶C)刺激后MDA5的表達情況，可能存在由于反饋調(diào)節(jié)對基因表達的抑制。另一方面，Poly(I∶C)導致外周血初始型CD4比例增高，類似于我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)的SIV病毒感染急性期初始型CD4增高[16]；而DEX無此效應。因此推測Poly(I∶C)可能模擬出SIV感染導致外周初始型CD4升高的誘導機制。值得我們進一步研究。

總之，兩種造模方式均可造成胸腺萎縮和功能損傷，但機制和病理表現(xiàn)截然不同。深入探討比較二者的異同，有助于選擇合適的模型、理解病毒感染損傷胸腺功能的機制，并最終助力相關疾病的研究和藥物研發(fā)。

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