細胞外液鈣離子濃度的改變對大鼠比目魚肌離體單一肌梭自發(fā)放電的影響

余　蕾， 趙雪紅， 樊小力， 曹 健

(1. 西安醫(yī)學(xué)院， 西安 710021； 2. 湖北文理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院機能學(xué)部， 襄陽 441053；3. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部， 西安 710016)

近年來我國載人航天事業(yè)蓬勃發(fā)展，已有多名宇航員被送入太空并開展了艙外活動。肌肉萎縮是中長期的載人航天飛行過程中宇航員經(jīng)常會出現(xiàn)的一種情況，尤其是下肢抗重力肌的萎縮。肌肉萎縮極大地影響了宇航員在航天飛行過程中的作業(yè)能力，而其返回地面后肌肉萎縮無法立即緩解，易出現(xiàn)平衡障礙、無法站立等情況，嚴重影響其地面上的工作與生活[1-2]。大量研究表明，失重性肌肉萎縮始于肌梭的改變。模擬失重環(huán)境下，可見血鈣升高并伴隨肌梭傳入放電的減少[3-4]，而鈣離子在肌梭電位的形成中起重要作用，兩者之間是否存在聯(lián)系目前尚未見相關(guān)報道。然而以往的研究多為在體研究，存在諸多影響因素，無法真實反映細胞外液鈣離子對肌梭傳入放電的影響。且以往多采用貓或蟾蜍作為研究對象，大鼠單一肌梭放電的相關(guān)研究則很少見。因此，本實驗運用空氣隔絕法，針對大鼠的比目魚肌單一肌梭的自發(fā)放電活動進行了記錄，觀察含有不同鈣離子濃度的細胞外液對肌梭自發(fā)傳入放電及氯化琥珀膽堿(Succinylcholine chloride，Sch)所引起的誘發(fā)放電的影響，以進一步探索失重和/或模擬失重所導(dǎo)致的肌萎縮的發(fā)生機制，為失重所致肌萎縮的發(fā)生機制提供新的實驗材料，為我國的航天事業(yè)服務(wù)。

1　材料與方法

1.1　實驗動物與藥品

實驗用雄性SD大鼠(n=10)購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，每只體重在200～220 g之間。按體重配對原則隨機將大鼠分為2組，即低鈣改良任氏液組(CaCl2濃度為 0.9 mmol/L，以下簡稱低鈣組)、高鈣改良任氏液組(CaCl2濃度為3.6 mmol/L，以下簡稱高鈣組)[7]，每組5只，實驗采用自身對照。Sch注射液(1 g/2 mL)，購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。

1.2　大鼠比目魚肌單一肌梭標(biāo)本的制備

腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠，取一側(cè)下肢比目魚肌置于改良任氏液(CaCl2濃度為 1.8 mmol/L)中，水浴37℃，持續(xù)通氧。以聚光燈為光源，在雙目解剖顯微鏡和倒置顯微鏡下，利用分離針分離肌梭。因肌梭與梭外肌平行排列，分離時應(yīng)沿著肌肉長軸逐步剝離肌梭周圍的梭外肌、血管等組織，直至分離出完整的肌梭及傳入神經(jīng)纖維(長度>3 mm)。

1.3　單一肌梭電活動記錄

實驗采用空氣隔絕法記錄單一肌梭傳入放電。將肌梭按其初長度固定置于實驗臺中的R池，肌梭傳入神經(jīng)纖維搭入K池中，R池與K池之間存在0.3 mm的空氣間隔。將改良任氏液充滿實驗臺的各池，以瓊脂鹽橋分別連接A池與K池、B池和R池以構(gòu)成回路，并用甘汞電極記錄A池和B池之間電位差，輸入記憶示波器(VC-11)觀察肌梭的傳入放電，同時輸入計算機做序列密度直方圖(圖1)。R池中的改良任氏液持續(xù)通氧，實驗中大鼠單一肌梭電活動的記錄在屏蔽箱內(nèi)完成。將制備好的肌梭標(biāo)本放入屏蔽箱內(nèi)通氧平衡10 min，而后給予低鈣改良任氏液、高鈣改良任氏液灌流，記錄肌梭自發(fā)傳入放電；給予50 mg/L Sch灌流，記錄肌梭誘發(fā)放電情況。

圖1 實驗裝置示意圖

A：改良任氏液池；B：改良任氏液池；C: 地線；E：甘汞電極；F：肌梭； G：傳入神經(jīng)纖維；I：監(jiān)聽放大器

1.4　數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計分析

2　結(jié)果

實驗觀察了不同鈣離子濃度的細胞外液對大鼠單一比目魚肌肌梭傳入放電的影響，結(jié)果如下。

低鈣組：實驗共記錄12例肌梭放電。待肌梭放電穩(wěn)定后觀察并記錄單一肌梭的傳入放電。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌梭在自然長度下有自發(fā)放電，其自發(fā)放電呈簇狀出現(xiàn)，每簇放電之間存在一定的周期間隔。肌梭置于改良任氏液中其自發(fā)放電的平均頻率為(0.08±0.02)Hz，峰值頻率為(19.00±2.46)Hz，自發(fā)放電的周期間隔為(3.16±0.21)min。給予低鈣改良任氏液灌流(8.89±0.92)min后，其自發(fā)放電頻率增加為(0.23±0.05)Hz(P<0.01)，峰值頻率為(25.18±5.04)Hz，自發(fā)放電的周期間隔縮短為(1.57±0.25)min(P<0.01)(見圖2和圖3)。肌梭自發(fā)放電在灌流后(14.88±1.37)min恢復(fù)正常。而后給予50 mg/L Sch灌流，12例肌梭中僅3例放電增加，誘發(fā)陽性率為25%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.13±0.03)Hz，峰值頻率為(23.00±4.69)Hz，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗無顯著性差異。

高鈣組：實驗共記錄12例肌梭放電。肌梭置于改良任氏液中其肌梭自發(fā)放電的平均頻率為(0.14±0.02)Hz，峰值頻率為(22.67±2.87)Hz，自發(fā)放電的周期間隔為(2.61±0.27)min。給予高鈣改良任氏液灌流(9.01±2.85)min后，自發(fā)放電頻率減少為(0.05±0.01)Hz(P<0.01)，峰值頻率降為8.78±1.71Hz(P<0.01)，自發(fā)放電的周期間隔延長為(5.28±1.01)min(P<0.05)(見圖2和圖4)。肌梭自發(fā)放電在灌流后(18.52±3.37)min恢復(fù)正常。而后給予50 mg/L Sch灌流，12例肌梭中僅4例放電增加，誘發(fā)陽性率為33.3%。誘發(fā)放電的平均頻率為(0.08±0.02)Hz，峰值頻率為(13.67±2.59)Hz，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗無顯著性差異。

圖2 不同濃度鈣溶液對大鼠單一比目魚肌肌梭傳入放電的影響

A為平均頻率(與對照組相比，下同)，*：P<0.01；B為峰值頻率，*：P<0.01; C為放電周期間隔，*：P<0.05

圖3 低鈣溶液對大鼠比目魚肌離體單一肌梭傳入放電的影響

A為對照組; B為低鈣溶液處理組

3　討論與結(jié)論

Ca2+在細胞外液、胞質(zhì)、鈣庫之間不斷移動，并在各部分維持著相對穩(wěn)定的濃度，這便是鈣穩(wěn)態(tài)。鈣穩(wěn)態(tài)的維持涉及一系列復(fù)雜的機制，它是細胞能完成一系列生理功能和Ca2+信號生成與轉(zhuǎn)導(dǎo)的基礎(chǔ)。Ca2+可以上調(diào)“早期應(yīng)答基因”c-myc和c-fos基因轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)其細胞膜受體表達增加，進而促進肌細胞有絲分裂以及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)沉積，最終導(dǎo)致肌細胞肥大和增生。受“早期應(yīng)答基因”的影響，還出現(xiàn)了肌細胞蛋白表型轉(zhuǎn)換和幼稚型骨骼肌的生長[6]。失重或模擬失重可以導(dǎo)致人和動物發(fā)生明顯的肌肉萎縮，其發(fā)生機制涉及神經(jīng)、體液、血液循環(huán)等多系統(tǒng)的改變。在太空微重力的環(huán)境中，宇航員可發(fā)生明顯的骨鈣丟失、血鈣增多，肌肉收縮能力下降[1-2]。這提示失重性肌萎縮的發(fā)生可能與細胞外液鈣異常增多有關(guān)。

圖4 高鈣溶液對大鼠比目魚肌離體單一肌梭傳入放電的影響

A為對照組;B:為高鈣溶液處理組

Ottoson和Fischer等用分離單一肌梭的方法分別對蛙和貓進行研究發(fā)現(xiàn)，改變細胞外液鈣離子濃度，肌梭的傳入放電和對牽拉的敏感性及適應(yīng)性也發(fā)生相應(yīng)的改變，且只有當(dāng)肌梭外囊由感覺區(qū)域部分剝離時，鈣離子才可引起傳入沖動發(fā)生較強較快的改變，細胞外液鈣離子濃度的改變對肌梭傳入放電的影響與梭內(nèi)肌纖維收縮無關(guān)[7-8]。該結(jié)論與本實驗研究結(jié)果基本一致，在鈣離子濃度為0.9mmol/L的細胞外液中肌梭自發(fā)傳入沖動增加，而在鈣離子濃度為3.6mmol/L的細胞外液中肌梭自發(fā)傳入沖動受到抑制。這種鈣離子所引起的傳入沖動的改變通常在鈣濃度改變后的幾分鐘才出現(xiàn)，提示肌梭的外囊起著重要的屏障作用，它可以阻止鈣離子的擴散。胞外鈣濃度改變引起傳入沖動的變化可能與以下原因有關(guān)：鈣離子可直接作用于肌梭感覺末梢膜的離子通道[7]，細胞外液低鈣可引起感覺末梢膜電位減小，其興奮性升高，電壓依賴性離子通道在去極化狀態(tài)下易于激活，自發(fā)傳入放電增多；與之相反，細胞外液高鈣則可使感覺末梢膜電位超極化，其興奮性降低，自發(fā)傳入放電減少。本實驗中低鈣組肌梭自發(fā)傳入放電頻率為(0.08±0.02)Hz，高鈣組肌梭自發(fā)傳入放電頻率為(0.14±0.02)Hz，兩者差距較大，這可能與肌梭來自不同的大鼠且給藥前肌梭的狀態(tài)不同有關(guān)，而本實驗采取自身前后對照設(shè)計，可避免個體差異對結(jié)果的影響。本實驗中低鈣組和高鈣組在給予Sch后均未見到肌梭傳入放電的增加，前者可能與肌梭長期處于低鈣液中梭內(nèi)肌纖維疲勞、能量消耗過多有關(guān)，而后者則與高鈣對Sch有一定拮抗作用[9]，且感覺末梢興奮性降低有關(guān)。

肌梭和梭外肌平行排列，肌梭位于其初長度時可產(chǎn)生自發(fā)的傳入放電，在重力的作用下，肌梭自發(fā)傳入放電不斷傳向中樞，從而產(chǎn)生了肌緊張，地球上的人和動物才能維持站立的狀態(tài)。然而載人航天飛行過程中，宇航員處于失重狀態(tài)，傳向中樞的肌梭自發(fā)放電減少，肌緊張減弱，肌肉萎縮。研究發(fā)現(xiàn)，在模擬失重條件下，肌梭的結(jié)構(gòu)和功能均有明顯改變，其變化早于、重于梭外肌。模擬失重情況下，細胞外液鈣離子濃度增高，肌梭自發(fā)放電減少，傳向中樞的神經(jīng)沖動減少，肌緊張減弱，肌肉活動減少，最終導(dǎo)致或加重了肌肉萎縮[10-11]。據(jù)此我們推斷，失重或模擬失重環(huán)境下，肌細胞外鈣離子濃度升高、鈣穩(wěn)態(tài)失衡，是導(dǎo)致肌梭的結(jié)構(gòu)與功能破壞，使其感受器功能喪失、傳入放電減少的重要原因。

本研究結(jié)果為失重所致肌萎縮的發(fā)生機制提供新的實驗材料，為大鼠肌梭生理的研究及鈣離子與失重性肌萎縮的實驗研究提供了有意義的資料。

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