四指馬鲅胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞免疫組織化學(xué)的定位

謝木嬌， 李加兒， 區(qū)又君， 溫久福， 李　活

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室， 廣州 510300； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306； 3. 茂名市金陽熱帶海珍養(yǎng)殖有限公司， 茂名 525444)

四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)，分類學(xué)上隸屬鯔形目(Mulgiliformes)馬鲅科(Polynemidae)四指馬鲅屬，廣泛分布于熱帶和溫帶的砂石底海區(qū)如澳大利亞東西海岸、美國夏威夷海域、印度尼西亞海域等，我國各海均有分布[1]，其肉質(zhì)鮮美，生長快，市價高，開發(fā)養(yǎng)殖前景看好，在中國臺、粵、浙、瓊等地區(qū)已有養(yǎng)殖[2-3]。

魚類消化道對食物的消化和吸收是直接關(guān)系魚類生長、發(fā)育和繁殖的重要生命活動, 內(nèi)分泌細(xì)胞能產(chǎn)生多種具有調(diào)節(jié)胃腸功能的胃腸激素，具有影響胃腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，控制攝食行為、調(diào)控消化道運動等功能，隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種魚類消化道內(nèi)分泌細(xì)胞的形態(tài)和分布特征被揭曉[4-8]，而國內(nèi)外關(guān)于四指馬鲅消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分布模式尚未見報道。該文利用SABC免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測6種胃腸激素樣5-羥色胺(5-hydroxytryptamine 5-HT)，生長抑素(somatostatin SS)，胃泌素(gastric GAS)，胰高血糖素(glucagon GLU)，神經(jīng)肽(neuropeptide Y NPY)，膽囊收縮素(cholecystokinin CCK-8)內(nèi)分泌細(xì)胞在其消化道的分布， 為深入了解四指馬鲅的消化生理，科學(xué)配制該魚營養(yǎng)與專用飼料提供生理生化依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試魚

四指馬鮁供試樣品為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所珠海試驗基地養(yǎng)殖的成魚群體，用網(wǎng)具隨機捕獲選擇5尾，魚體健康，體質(zhì)量范圍300～325 g。

1.2　取材及蠟塊制備

現(xiàn)場采集的成魚，經(jīng)生物學(xué)測定后，迅速放置冰盤上解剖，取出消化道并分段為食道、賁門部、胃體部、幽門部、盲囊部、前腸、中腸和后腸，立即放入Bouins液中固定，固定時間為24 h，把組織修整為合適形狀和大小后放入包埋框內(nèi)進行流水沖洗至黃色褪去，用梯度酒精進行脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。

1.3　切片

用Leica 切片機進行4～5 μm超薄切片，放置于經(jīng)過多聚賴氨酸處理的防脫載玻片，60℃下烘烤1 h，冷卻至室溫后放入4℃冰箱密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4　一抗準(zhǔn)備和最佳濃度選擇

兔抗5-羥色胺(5-hydroxytryptamine 5-HT)、兔抗生長抑素(somatostatin SS)、兔抗胃泌素(gastrin GAS)以及兔抗胰高血糖素(glucagon GLU)的工作濃度為1∶100，兔抗神經(jīng)肽(neuropeptide Y NPY)的工作濃度為1∶80，兔抗膽囊收縮素(cholecystokinin CCK-8)的工作濃度為1∶75。以上試劑均為武漢博士德生物工程有限公司的產(chǎn)品。

1.5　免疫組化染色

由1.3準(zhǔn)備的切片染色參照SA2010-小鼠IgG/兔IgG免疫組化染色試劑盒石蠟切片微波修復(fù)抗原染色方法進行，具體如下：

1)切片脫蠟至水；2)用30%H2O2室溫避光孵育10 min滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水水洗2 min×3次；3)將切片浸入0.01 mol/L，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，微波爐加熱至沸騰后斷電，循環(huán)2～3次，充分修復(fù)抗原，冷卻至室溫；4)滴加適當(dāng)濃度的一抗，4℃孵育過夜，次日復(fù)溫30 min，用0.02 mol/L PBS 洗滌2 min×3次；5)加入生物素化山羊抗小鼠/兔IgG(效價1∶100)20～37℃孵育20 min，0.02 mol/L PBS 洗滌2 min×3次;6)加入試劑SABC(效價1∶100)20℃～37℃孵育20 min，0.02 mol/L PBS 洗滌5 min×4次；7)取1 mL蒸餾水加入DAB顯色試劑盒(AR1022)的A、B、C試劑各一滴混勻配制成工作濃度DAB加入切片，室溫顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，用蒸餾水充分洗滌終止酶促反應(yīng);8)蘇木素輕度復(fù)染后用梯度酒精進行脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。

一抗、二抗均用0.02 mol/L、pH 7.2～7.6 的PBS進行稀釋。

1.6　數(shù)據(jù)測量及統(tǒng)計

在顯微照相系統(tǒng)下觀察，消化道的各部位隨機選取 10 張相鄰的切片, 每張切片隨機取3個200 倍視野進行觀察, 測量100 μm×100 μm范圍內(nèi)陽性細(xì)胞的數(shù)目(n=30)，表示該細(xì)胞的密度(個/mm2)，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPASS 17.0進行單因素方差分析(one way ANOVA)，在α=0.05水平下進行Duncan′s多重比較。

2　結(jié)果

2.1　免疫陽性細(xì)胞的分布

據(jù)DAB顯色結(jié)果，以含有棕黃或黑色沉淀或整個細(xì)胞染成棕黃或黑色的為免疫陽性細(xì)胞(immunoreactive cell IR cell)。按形態(tài)可分為開放型內(nèi)分泌細(xì)胞(呈長錐形或棱形，有明顯胞突深入消化腔中)和封閉型內(nèi)分泌細(xì)胞(不具有胞突)。

本次試驗共使用6種兔抗胃腸激素樣抗體，而四指馬鲅食道內(nèi)未檢測出任何一種IR細(xì)胞。胃部只檢測出GAS和SS陽性細(xì)胞，但GAS細(xì)胞僅限在幽門部，密度較少，只有(10.38±3.34)個/mm2，前腸道只檢測到GAS細(xì)胞，密度為(40.18±5.78)個/mm2。胃部各區(qū)域分布極多的SS陽性細(xì)胞，細(xì)胞被染成棕黑色，其密度在賁門部、幽門部、胃體部、盲囊各部位分別是(48.35±9.83)、(23.02±10.23)、(234.50±23.45)、(37.33±8.34)個/mm2，但胃腺腺泡內(nèi)的SS細(xì)胞數(shù)量不如賁門部多。幽門盲囊同樣只檢測出SS細(xì)胞，密度為(47.02±14.81)個/mm2，中腸未檢測出任何IR細(xì)胞，后腸則有GAS和SS細(xì)胞的分布，GAS細(xì)胞密度為(40.44±2.76)個/mm2，SS細(xì)胞密度為(22.73±3.91)個/mm2(表1)。而在整個消化道均未檢測出5-HT、GLU、NPY和(CCK-8)4種陽性反應(yīng)的細(xì)胞。

2.2　免疫陽性細(xì)胞的形態(tài)特征

2.2.1GAS-IR細(xì)胞

幽門部和前腸的GAS細(xì)胞主要分布在黏膜上皮，細(xì)胞多為圓形，為封閉型細(xì)胞，靠近黏膜下層可見少量長錐形開放型陽性細(xì)胞(圖1-A、B、C)。后腸的GAS細(xì)胞主要定位于較為細(xì)長的絨毛黏膜上皮間，為長梭狀的開放型細(xì)胞(圖1-D、E、F)。

表 1 四指馬鲅消化道免疫陽性細(xì)胞的分布特征

上標(biāo)不同字母表示部位間差異顯著(P<0.05)

圖1 四指馬鲅消化道的胃泌素免疫陽性細(xì)胞

A,B: 幽門部；C,D：前腸；E,F：后腸

2.2.2SS-IR細(xì)胞

賁門部胃腺組織未如胃體部豐富，腺泡封閉型SS細(xì)胞數(shù)量較少，也有少量開放三角錐形細(xì)胞(圖2-A)。幽門部缺乏胃腺，SS細(xì)胞分布在黏膜上皮層(圖2-B)，卵圓形和長錐形細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)。胃體部SS細(xì)胞密度最大，由胃腺與黏膜上皮交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的區(qū)域分布極為多量的SS細(xì)胞，在胃腺腺泡上的主要為封閉的卵圓形細(xì)胞，腺泡上還可見2個或2個以上的SS細(xì)胞聚集成團，而在黏膜上皮的多為開放錐形細(xì)胞(圖2-C)。盲囊部SS細(xì)胞分布和形態(tài)與賁門部相似(圖2-D)，均為封閉型內(nèi)分泌細(xì)胞，呈圓型，主要分布在靠近黏膜下層的黏膜上皮細(xì)胞間(圖2-E)。分布在上皮基底層細(xì)胞之間，呈梭形，為開放型細(xì)胞，高倍鏡下，伸入腸管的胞突清晰可見(圖2-F)。后腸的SS細(xì)胞多位于較為細(xì)長的絨毛黏膜上皮間，均為長梭狀的為開放型細(xì)胞(圖1-D、E、F)。

圖2 四指馬鲅消化道的生長抑素免疫陽性細(xì)胞

A：賁門部：B: 幽門部；C：胃體部；D：盲囊部；E：幽門盲囊；F：后腸

3　討論

3.1　四指馬鲅消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分布特征

3.2　內(nèi)分泌細(xì)胞的功能

不少研究證實魚類消化道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的內(nèi)分泌激素或單獨作用或通過調(diào)節(jié)其他激素的分泌等作用來調(diào)控機體的消化吸收和生長代謝過程。胃泌素生理作用主要是促進胃酸分泌[24]，如日本鰻鱺(Anguillajaponica)胃體部、幽門部和前腸、中腸均存在GAS細(xì)胞[25]，大黃魚GAS分布于胃幽門部和前腸、中腸、后腸，而四指馬鲅除幽門部、幽門盲囊和腸道檢測有GAS細(xì)胞外，其余均未檢測出，推測因該魚幽門部缺乏胃腺，而由GAS細(xì)胞分泌胃酸起一定的協(xié)助食物消化的作用。5-HT細(xì)胞能分泌激素促進胃腸蠕動[22]，有胃魚類如大黃魚、褐籃子魚、褐牙鲆消化道各段均有5-HT免疫陽性細(xì)胞的分布；大彈涂魚在食道、賁門胃和直腸有5-HT細(xì)胞的分布[12]，無胃魚類如鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)、團頭魴(Megalobramaamblycephala)、銀鯽(CarassiusauratusgibeliovarSongpu)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、青魚和鯉等的前腸也有5-HT細(xì)胞的分布，5-HT細(xì)胞在多種魚類消化道存在的特點說明其分泌的激素在調(diào)控機體消化吸收具有不可替代的作用[26]。SS是抑制性激素，能抑制胃泌素的釋放，四指馬鲅胃部分布大量的SS細(xì)胞，而GAS細(xì)胞較少，推測可能是SS細(xì)胞存在而導(dǎo)致的結(jié)果。CCK細(xì)胞能抑制胃排空和酸的排出[10]，NPY細(xì)胞可促進胃腸道血管收縮,使胃腸道的平滑肌收縮，進而引起胃容受性收縮，黏膜下層的NPY能直接調(diào)節(jié)腸上皮的吸收，不同種屬魚類胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞的分布模式各異，由其分泌不同激素對機體消化吸收和生長代謝活動進行精細(xì)的調(diào)控，而四指馬鲅內(nèi)分泌細(xì)胞在早期發(fā)育階段的發(fā)生分布，以及各種激素的作用規(guī)律，作用機制還有待進一步研究。

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