半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)CD80的基因表達以及重組CD80與外周血淋巴細胞的結合分析

陳　晨, 李墨非， 孫 黎

(1.中國科學院海洋研究所 海洋生物學重點實驗室, 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

CD80為抗原遞呈細胞上一種膜糖蛋白，隸屬于免疫球蛋白超家族[1-2]。在免疫系統(tǒng)中，抗原遞呈細胞表面的CD80分子和免疫球蛋白超家族中的另一成員CD86與T淋巴細胞表面的配體CD28結合，從而協(xié)同刺激T細胞增殖、活化[3]，在機體清除病原體以及體液免疫與細胞免疫過程中發(fā)揮重要作用。

關于CD80的功能研究主要集中在哺乳動物中和少數(shù)鳥類中[3]。在人類的抗原遞呈過程中，CD80通過與輔助T細胞前體細胞(Thp)表面的CD28分子結合，使Thp分化形成輔助T細胞(Th)細胞，Th細胞通過分泌細胞因子增強免疫效應并激活下一步免疫反應[4]。目前在魚類中關于CD80的報道較少，Zhang等對虹鱒魚的CD80/86分子進行了克隆鑒定及功能分析，發(fā)現(xiàn)CD80/86基因在大腸桿菌脂多糖和弧菌毒素刺激下表達顯著上調，且CD80/86能調節(jié)IL-2基因的表達，說明CD80/86在抵抗細菌侵染、調控機體免疫反應中起重要作用[3]。Shao等發(fā)現(xiàn)斑馬魚樹突細胞上存在CD80/86，并具有與哺乳動物中的CD80相似功能[1]。湯菊芬等對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus) CD80分子進行了克隆鑒定，并分析了健康狀態(tài)及細菌感染后CD80在羅非魚不同組織中的基因表達情況[5]。但是，在我國經濟養(yǎng)殖魚類半滑舌鰨中，CD80尚未有研究。

半滑舌鰨是中國珍貴的海水養(yǎng)殖魚類，因味道鮮美、營養(yǎng)豐富深受廣大消費者的喜愛，具有很大的市場經濟價值。然而，由細菌、病毒引起的疾病給半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經濟損失，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和細胞腫大病毒是引起半滑舌鰨細菌性疾病的主要病原微生物[6-7]。本研究從半滑舌鰨基因組數(shù)據(jù)庫中克隆得到CD80的基因(命名為CsCD80)，檢測了CsCD80在健康半滑舌鰨和病原感染的半滑舌鰨不同組織中的表達情況，并且檢測了重組表達的CsCD80蛋白與半滑舌鰨外周血淋巴細胞(PBL)的結合能力。

1　材料和方法

1.1　材料

半滑舌鰨購于山東青島商業(yè)化養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于20℃通氣海水中2周。哈維氏弧菌(V.harveyi)[8]、細胞腫大病毒RBIV-C1[9]由實驗室分離保存。反轉錄試劑盒、熒光實時定量試劑盒(SYBR EXScript qRT-PCR Kit)等購自TaKaRa生物有限公司； RNA提取試劑盒(EZNA Total RNA Kit)、凝膠回收試劑盒購自Omega公司，RNA反轉錄試劑盒購自Thermo公司，Leibovitz′s L15培養(yǎng)液購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司，小鼠抗His抗體， FITC標記的羊抗小鼠IgG抗體購自康為試劑公司。蛋白表達載體pET32a 購自Novagen公司。序列測序及引物合成由青島擎科梓熙生物技術有限公司完成。

1.2　方法

1.2.1 CsCD80 基因序列獲得及序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中半滑舌鰨的全基因組中獲得CsCD80的基因序列，信號肽序列預測采用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，保守結構域預測采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)，多重序列比對使用DNAMAN，比對結果以序列相似度(sequence identity)形式表示。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測CsCD80在不同組織中的表達量

為檢測正常生理狀況下CsCD80在不同組織中的表達量，將健康半滑舌鰨隨機分組，每組5條，麻醉后取心臟、血、肝、脾、頭腎、鰓、肌肉、腦和腸組織，按照EZNA Total RNA Kit說明提取總RNA，用Nanodrop測定其純度，通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。并根據(jù)反轉錄試劑盒使用說明反轉錄成 cDNA，以該cDNA 為模板，β-actin 基因為內參基因進行實時熒光定量 PCR。根據(jù) β-actin 基因和CsCD80 基因序列分別設計引物為：β-actin-F(5′-GCACGGTATTGTGACCAACTGG-3′)、β-actin-R(5′-CAGGGGAGCCTCTGTGAGC-3′)、CsCD80-RT-F(5′-CCAGAAACCAAGATGAGGATGA-3′)、CsCD80-RT-R(5′-TGAAGACAGCGGTGGAGGA-3′)。反應體系為20 μL， 包括SYBR Premix ExTaq10 μL，CsCD80-RT-F(β-actin-F) 0.2 μL，CsCD80-RT-R(β-actin-R) 0.2 μL，ddH2O 7.6 μL，cDNA模板2 μL。在Eppendorf Mastercycle實時定量 PCR 儀上進行， 反應程序為： 95℃預變性30 s；95℃退火5 s，59℃退火30 s， 72℃延伸10 s， 40個循環(huán)。采用 2-ΔΔCT法計算CsCD80表達量[10]， 并使用 Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。

為檢測在哈維氏弧菌(V.harveyi)刺激下CsCD80表達量的變化，使用LB培養(yǎng)基將V.harveyi培養(yǎng)至OD600=0.8，用PBS緩沖液洗3次并重懸至2×106CFU/mL，制成細菌懸液備用。將健康半滑舌鰨隨機分成2組，每組20條，實驗組每條注射50 μL細菌注射液，對照組每條注射50 μL PBS，均采用腹腔注射。感染6、12、24和48 h后取樣，每個處理每個時間點隨機選取5條魚，收集肝、脾和頭腎組織。分別以18S rRNA、ribosomal protein L18(RPL18)和β-actin作為內參基因，按照上述方法檢測細菌刺激后半滑舌鰨肝、脾、頭腎組織中的CsCD80表達量變化。

圖1 CsCD80相似序列比對Fig 1 Alignment of the sequences of CsCD80 homologues括號內為CsCD80與比較序列的相似度。保守氨基酸殘基用黑色陰影標出，相似度>75%的氨基酸殘基用紅色陰影標出，相似度>50%的氨基酸殘基用藍色陰影標出。

為檢測在細胞腫大病毒RBIV-C1刺激下CsCD80表達量的變化，用PBS緩沖液將RBIV-C1病毒組織液稀釋到5×105拷貝/mL制成病毒注射液備用。將健康半滑舌鰨隨機分成2組，每組20條，實驗組每條注射50 μL病毒注射液。對照組每條腹腔注射50 μL PBS，均采用腹腔注射。侵染后1、3、5和7 d時取樣，每個處理組每個時間點隨機選取5條魚，收集肝、脾和頭腎組織。以β-actin作為內參基因，按照上述方法檢測病毒刺激后半滑舌鰨肝、脾和頭腎組織中的CsCD80表達量變化。每組實驗重復3次。

1.2.3重組CsCD80蛋白(rCsCD80)和重組Trx蛋白(rTrx)的表達和純化

重組蛋白表達使用蛋白表達載體pET32a。首先構建重組表達質粒pETCsCD80，設計特異性引物CsCD80-F(5′-CCCGGGATGGGAGGTCTCCTGCA-3′ ，加下劃線的序列為SmaI酶切位點)、CsCD80-R(5′-CCCGGGAGTATTTGGCCAGTCGGG-3′，加下劃線的序列為SmaI酶切位點)擴增CsCD80的胞外段(34～241位氨基酸)，PCR產物克隆至T-A的克隆載體pEASY-T1后，提取質粒，重組質粒用SmaI內切酶消化后，切膠回收酶切目的片段，將回收的酶切目的片段插入表達質粒pET32a。經轉化、挑選單克隆、菌落PCR和測序確認后，將重組表達質粒轉入大腸桿菌BL21中，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600=0.5，加入0.4 mmol/L IPTG后，于16℃誘導培養(yǎng)12 h，收集菌液，經液氮速凍、超聲破碎后，使用Ni-NTA瓊脂糖柱純化蛋白質，將純化后的重組CsCD80蛋白(rCsCD80)裝入透析袋中進行復性[11]。同時，使用pET32a表達重組標簽蛋白rTrx，作為后續(xù)實驗的對照蛋白。蛋白濃度使用Nanodrop測定。

1.2.4rCsCD80與半滑舌鰨外周血淋巴細胞(PBL)的相互作用

用Percoll密度梯度離心法[12]提取健康半滑舌鰨(750±10)g的外周血淋巴細胞，在L15培養(yǎng)液中稀釋至1×108細胞/mL，將rCsCD80、rTrx加入PBL懸液中，使其終濃度為80 μmol/L，28℃孵育2 h后，PBS洗3次，加入稀釋1000倍的小鼠抗His抗體，37℃孵育1 h后，PBS洗3次，加入稀釋1000倍的FITC標記的羊抗小鼠IgG抗體，37℃避光孵育1 h后，PBS洗3次，滴加至載玻片上，蓋上蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2　結果

2.1　CsCD80序列分析

CsCD80基因序列開放閱讀框含有882個堿基，共編碼293個氨基酸，其理論分子質量為32.45 ku，理論等電點pI=7.97，N-末端1～31位氨基酸殘基為信號肽序列，37～129位氨基酸殘基為免疫球蛋白V區(qū)(IgV)結構域，是免疫球蛋白超家族的保守特征，233～267位氨基酸為α螺旋的跨膜(TM)結構域。氨基酸組成中絲氨酸(Ser)含量最高，占11.26%。選取與CsCD80序列相似度最高的前7個物種進行多重序列比對(這7個物種按相似度從高到低，其GenBank登錄號依次為：XP_019950451.1、XP_019903483.1、XP_014070714.1、ACH58053.1、XP_017346141.1、XP_018918527.1、XP_017206576.1)。結果表明，CsCD80與牙鲆(Paralichthysolivaceus)CD80相似性最高，為41.37%，與其他魚類的CD80相似性較低(19.01%～41.37%)，見圖1。

2.2　CsCD80在半滑舌鰨不同組織中的表達

通過實時熒光定量PCR技術檢測CsCD80在健康半滑舌鰨的不同組織中的表達情況。實驗結果顯示，CsCD80在檢測的9種組織中均有表達，其中在肝中表達量最高，其次為脾、心、腦、鰓、肌肉、腎、腸和血，肝中的表達量為血中的表達量的508.2倍(圖2)。

2.3 哈維氏弧菌、細胞腫大病毒感染后半滑舌鰨中CsCD80的表達

在V.harveyi感染半滑舌鰨6、12、24和48 h后，通過熒光定量PCR技術檢測CsCD80在肝、脾、頭腎中的表達情況。實驗結果顯示，肝中CsCD80在感染后6、12、24和48 h表達量均有顯著上調，脾中CsCD80在感染后6 h表達量顯著上調，頭腎中CsCD80在感染后6、12和24 h表達量均有顯著上調，在肝、脾、頭腎中CsCD80的最大表達量分別出現(xiàn)在感染后的24、6和24 h，表達量為對照組的66.7倍、14.3倍和3.3倍(圖3-A～C)。在病毒RBIV-C1感染半滑舌鰨的1、3、5和7 d后，通過熒光定量PCR技術檢測CsCD80在肝、脾、頭腎中的表達情況。實驗結果顯示，肝中CsCD80在感染后3、5和7 d表達量均有顯著上調，脾中CsCD80在感染后1 d和3 d表達量均有顯著上調，頭腎中CsCD80在感染后1、3、5和7 d表達量均有顯著上調，在肝、脾和頭腎中CsCD80的最大表達量分別出現(xiàn)在感染后的3 d、3 d和7 d，表達量為對照組的9.6倍、12.3倍和6.2倍(圖3-D～F)。

圖2 CsCD80在健康的半滑舌鰨組織中的表達情況

為方便比較，將血中的相對表達量設為1；數(shù)據(jù)為3次實驗數(shù)據(jù)的平均值，以平均值±標準誤差表示

圖3 細菌、病毒感染后CsCD80在半滑舌鰨組織中的表達情況

實驗組半滑舌鰨感染哈維氏弧菌(A～C)和細胞腫大病毒(D～F)；對照組半滑舌鰨未感染細菌和病毒，用實時熒光定量PCR技術測定不同時間點CsCD80在肝、脾、腎中的相對表達量。對照組的相對表達量設為1，數(shù)據(jù)為3次實驗數(shù)據(jù)的平均值，以平均值±標準誤差表示。*P< 0.05；**P< 0.01

2.4　rCsCD80與半滑舌鰨外周血淋巴細胞(PBL)的結合

通過原核表達的方法獲得rCsCD80和rTrx(圖4)。rCsCD80和rTrx與半滑舌鰨的PBL孵育后，用帶有綠色熒光的抗體檢測與細胞結合的重組蛋白。結果表明，rCsCD80與PBL孵育后，在熒光顯微鏡下觀察到PBL表面有綠色熒光，而rTrx與半滑舌鰨PBL孵育后，在PBL表面未觀察到綠色熒光(圖5)。該結果說明rCsCD80能夠與PBL結合。

圖4 rCsCD80和 rTrx的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig 4 SDS-PAGE analysis of rCsCD80 and rTrx

泳道1：蛋白Marker；泳道2：重組表達的CsCD80蛋白；泳道3：重組Trx蛋白

圖5 rCsCD80與半滑舌鰨外周血淋巴細胞(PBL)的結合Fig 5 Binding of rCsCD80 to the peripheral blood lymphocytes(PBL) of C. semilaevis

半滑舌鰨PBL先與rCsCD80(A-C)或rTrx(D-F)孵育后，再與抗His-tag抗體孵育，隨后與FITC標記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下觀察。C為A、B融合后的圖；F為D、E融合后的圖

3　討論

本研究從半滑舌鰨全基因組數(shù)據(jù)庫中克隆得到了CsCD80序列。序列分析表明，CsCD80與牙鲆CD80同源性最高。氨基酸序列分析表明，CsCD80包含兩個保守結構域，即免疫球蛋白V區(qū)結構域和α螺旋結構跨膜結構域，而在虹鱒魚中，CD80不僅包含這兩個保守結構域，還包含一個免疫球蛋白C區(qū)(IgC)結構域[3]。這些結果說明在不同魚類中CD80存在序列和結構上的差異。

組織特異性表達分析表明，在健康狀態(tài)的半滑舌鰨中，CsCD80在9種組織中有不同程度的表達，其中在肝和脾中的表達量較高，該結果與已報道的尼羅羅非魚組織表達情況較相似[5]，而在虹鱒魚中，CD80在血中表達量最高，脾中表達量次之[3]。這可能是由于虹鱒和半滑舌鰨免疫機制存在差別有關。在人類CD80研究中， CD80分子存在于肝細胞表面，且在丙型肝炎病毒刺激下，CD80在肝細胞中表達量上調，說明在人體中CD80可能發(fā)揮保護肝細胞的作用[13]。此外，肝是補體合成的主要器官，因此推測半滑舌鰨中CsCD80在肝中表達量最高可能是一種自身保護機制，保護細胞免受由補體引起的損傷。脾臟是魚類重要的免疫器官，是魚類機體中中性粒細胞、 紅細胞等產生、 儲存和成熟的主要場所，具有產生各種免疫細胞的功能，在魚類特異性免疫過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。在本研究中，CsCD80在半滑舌鰨脾臟中有大量表達，可能說明CsCD80在脾臟中參與半滑舌鰨的免疫進程。

在虹鱒CD80研究中發(fā)現(xiàn)，用大腸桿菌脂多糖和弧菌毒素對虹鱒進行免疫刺激后，CD80表達量顯著上調[3]。在尼羅羅非魚中，用滅活無乳鏈球菌對其進行免疫刺激后，CD80在羅非魚的腸、鰓、腦、脾、腎、胸腺中表達量均顯著上調[5]。在本研究中也存在類似現(xiàn)象，V.harveyi和細胞腫大病毒是半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)中的常見病原微生物[6-7]，在V.harveyi和細胞腫大病毒感染半滑舌鰨后，CsCD80在肝、脾、頭腎中的表達量均呈現(xiàn)顯著上調，且呈現(xiàn)出時間依賴性表達模式。這些結果表明CsCD80可能在半滑舌鰨抵抗V.harveyi和細胞腫大病毒侵染的免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。

在人類CD80研究中發(fā)現(xiàn)，CD80能刺激PBL使其增殖，從而增強機體的免疫反應[16]。在本研究中，rCsCD80與半滑舌鰨PBL孵育后，通過免疫熒光檢測，可觀察到半滑舌鰨PBL表面出現(xiàn)綠色熒光，說明rCsCD80能結合到PBL表面，由此推測半滑舌鰨PBL表面可能存在rCsCD80的配體，rCsCD80通過與PBL表面配體結合，可能會進一步刺激PBL增殖從而加強機體的免疫反應強度。

4　結論

本研究克隆了半滑舌鰨CsCD80的DNA序列，通過序列比對發(fā)現(xiàn)其與牙鲆CD80序列相似度最高。在健康狀態(tài)的半滑舌鰨中，CsCD80在肝和脾中具有高表達量，在細菌和病毒感染后，CsCD80 在肝、脾、頭腎中表達量均有顯著上調，且呈現(xiàn)時間依賴模式，揭示CsCD80可能在半滑舌鰨的抗感染免疫應答過程中起重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)rCsCD80能夠結合到PBL表面，暗示rCsCD80可能通過與PBL上的配體結合而引發(fā)細胞免疫應答反應。本研究結果為深入研究半滑舌鰨CD80的免疫機制奠定了基礎。

[1]SHAO T, ZHU L Y, NIE L, et al. Characterization of surface phenotypic molecules of teleost dendritic cells[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2015, 49(1): 38-43.

[2]任亞琳. B7-CD28 家族成員的免疫調節(jié)功能及其最新研究進展[J]. 國外醫(yī)學免疫學分冊, 2006, 28(6): 324-327.

[3]ZHANG Y A, HIKIMA J, LI J, et al. Conservation of structural and functional features in a primordial CD80/86 molecule from rainbow trout(Oncorhynchusmykiss), a primitive teleost fish[J]. The Journal of Immunology, 2009, 183(1): 83-96.

[4]KUCHROO V K, DAS M P, BROWN J A, et al. B7-1 and B7-2 costimulatory molecules activate differentially the Th1/Th2 developmental pathways: application to autoimmune disease therapy[J]. Cell, 1995, 80(5): 707-718.

[5]汪志文, 張海艷, 黃 瑜, 等. 尼羅羅非魚 CD80 基因的分子克隆與 mRNA 表達分析[J]. 基因組學與應用生物學, 2017(1): 190-200.

[6]戴 歡, 劉 洋, 王文文, 等. 半滑舌鰨抗哈維氏弧菌病相關微衛(wèi)星標記篩選及 QTL 定位[J]. 中國水產科學, 2017, 24(1): 22-30.

[7]張寶存. 虹彩病毒 RBIV-C1 分子病原特征及其誘導海水魚類免疫應答反應的研究[D]. 北京：中國科學院大學, 2014.

[8]SUN K, ZHANG W W, HOU J H, et al. Immunoprotective analysis of VhhP2, aVibrioharveyivaccine candidate[J]. Vaccine, 2009, 27(21): 2733-2740.

[9]ZHANG J, LI M F. ORF75 of megalocytivirus RBIV-C1: a global transcription regulator and an effective vaccine candidate[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2015, 45(2): 486-494.

[10]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2- ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[11]LI M F, WANG C, SUN L.EdwardsiellatardaMliC, a lysozyme inhibitor that participates in pathogenesis in a manner that parallels Ivy[J]. Infection and Immunity, 2015, 83(2): 583-590.

[12]LONG H, CHEN C, ZHANG J, et al. Antibacterial and antiviral properties of tongue sole(Cynoglossussemilaevis) high mobility group B2 protein are largely independent on the acidic C-terminal domain[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2014, 37(1): 66-74.

[13]FIORE G, PIAZZOLLA G, GALETTA V, et al. Liver tissue expression of CD80 and CD95 antigens in chronic hepatitis C: relationship with biological and histological disease activities[J]. Microbios, 1999, 97(386): 29-38.

[14]孫德文, 詹 勇, 許梓榮. 魚類免疫系統(tǒng)的研究進展[J]. 水利漁業(yè), 2002, 22(6): 17-19.

[15]王俊相, 李玉萍, 孔令富, 等. 魚類免疫系統(tǒng)的研究進展[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2010(7): 29-31.

[16]KOC S, KATHER A, MARKERT U R, et al. Enhancement of immunogenicity of Jeg3 cells by ectopic expression of HLA‐A* 0201 and CD80[J]. American Journal of Reproductive Immunology, 2003, 50(3): 243-253.