1 株豬源大腸桿菌O 抗原的鑒定及其耐藥試驗

申子平, 郭丹丹, 孔慶娟, 王鐵崗, 原慧斌

(1.長治職業(yè)技術(shù)學院動物科學系, 山西 長治046000 ;2.四川恒通動物制藥有限公司, 四川 內(nèi)江641000)

山西省長治某規(guī)模豬場為一新建場,因為管理不善,致使產(chǎn)房3 日齡內(nèi)仔豬多數(shù)發(fā)病。 主要癥狀為糞便稀、黃,消瘦,最后脫水衰竭而死。 剖檢見腸黏膜充血、水腫,腎出血,淋巴腫大等病變。 初步診斷為仔豬黃痢。 為了進一步確診和防治該病,進行了大腸桿菌抗原類型的鑒定和耐藥性試驗。

1 材料

1.1 試劑 麥康凱(MC)瓊脂和營養(yǎng)肉湯由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);伊紅美藍(EMB)瓊脂培養(yǎng)基由宿遷華夏生化科技有限責任公司生產(chǎn);營養(yǎng)瓊脂由北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);微量生化管由青島海博生物有限公司生產(chǎn);藥敏片由上海騰騫生物科技有限公司生產(chǎn);大腸桿菌單因子血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)。

1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)箱,購自上海博泰實驗設(shè)備有限公司;低溫冰箱,購自青島海爾股份有限公司;壓力蒸汽滅菌鍋,購自上海申安醫(yī)療器械廠;微量移液槍,購自大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司;電子天平,購自北京賽多利斯儀器有限公司。

1.3 病料 截取山西省武鄉(xiāng)縣某規(guī)模養(yǎng)豬場拉黃稀糞便仔豬的十二指腸作為病料。

2 方法

2.1 病菌的鑒定

2.1.1 分離和鏡檢病菌 無菌條件下接種十二指腸病料到MC 瓊脂上,37 ℃溫度下培養(yǎng)18 h。 然后從MC 瓊脂上挑取單個的粉紅色菌落,接種到普通肉湯、EMB 瓊脂、普通瓊脂上,37 ℃溫度下24 h 的培養(yǎng)。 分別挑EMB 瓊脂和MC 瓊脂上的菌落,進行涂片和染色,用顯微鏡的油鏡觀察。

2.1.2 生化試驗檢測 用分離菌進行生化檢測,檢測項目有：乳糖、山梨醇、蔗糖、H2S、麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、M. R、檸檬酸鹽、尿素酶、三糖鐵、V-P、肌醇和賴氨酸等。

2.2 毒力測定 測定試驗用小鼠(體重25 g)進行。 采用腹腔接種的方法,每組接種3 只小鼠。 試驗組：先用肉湯稀釋肉湯培養(yǎng)物至5 億/mL,再用注射器抽取0.2 mL 稀釋后的培養(yǎng)物進行接種。 對照組：接種0.2 mL 無菌肉湯。 接種后詳細記錄小鼠癥狀及死亡情況。 若3 d 內(nèi)全部死亡則判定病菌有強致病性、高毒力;發(fā)病死亡2 只,判定有中等致病性和中等毒力;發(fā)病死亡1 只,判定有低致病性和低毒力;零死亡,判定為無致病性和無毒力。

在MC 瓊脂上接種病死鼠的心血。 培養(yǎng)后鏡檢。

2.3 病菌抗原類型測定 對生化試驗符合大腸桿菌特點的分離菌進行O 抗原類型的鑒定。 先用普通瓊脂純化生化鑒定后的細菌,再用石炭酸(5 mL/L)生理鹽水沖洗,稀釋(1 ×1010CFU/mL)。經(jīng)2 h,121 ℃高壓滅菌[1]。 試驗玻片凝集法：用移液槍往玻片上滴一滴稀釋后的細菌液,再往細菌上滴一滴定型血清,混勻后反應(yīng)5 min。 如液滴明顯凝集,判定反應(yīng)為陽性。 為防止自凝,用無菌生理鹽水和菌液混合設(shè)為對照。

2.4 耐藥試驗 用藥敏試紙片進行試驗。 試紙片有卡那霉素、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、阿莫西林、利福平、鏈霉素、頭孢唑啉、慶大霉素、阿米卡星、呋喃唑酮和頭孢曲松等[2-3]。

3 結(jié)果

3.1 鑒定結(jié)果 見表1。

表1 病菌鑒定結(jié)果

3.2 毒力測定結(jié)果 經(jīng)過用小鼠試驗,試驗組的小鼠全部在48 h 內(nèi)死亡。 說明該株細菌的致病性強、毒力高。 剖檢死亡小鼠,見有肝和脾腫大,肝面有壞死和出血。 采集肝作為病料,接種、培養(yǎng)后鑒定,符合大腸桿菌特征。

3.3 O 抗原鑒定結(jié)果 經(jīng)O 抗原鑒定試驗,發(fā)現(xiàn)單因子O8血清中出現(xiàn)了凝集,所以該株大腸桿菌的O 型抗原為O8。

3.4 耐藥試驗結(jié)果 見表2。 由表2 得出,該株大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢曲松、阿米卡星和呋喃唑酮敏感;對頭孢唑啉、卡那霉素、頭孢噻肟等中度敏感;而對環(huán)丙沙星、鏈霉素和利福平等耐藥。

表2 耐藥試驗結(jié)果

4 討論

4.1 關(guān)于毒力 經(jīng)過試驗,得出該場流行的仔豬黃痢的病原為O8血清型的大腸桿菌。 針對該菌做了毒力強弱的測定,發(fā)現(xiàn)該型細菌致病性強、毒力高,這和該場生產(chǎn)中仔豬成批死亡,病死率高達43%相符。 為減少該病的發(fā)生,建議自制疫苗進行預防。

4.2 關(guān)于耐藥性 試驗找出了該株細菌對氧氟沙星、頭孢曲松、阿米卡星和呋喃唑酮敏感。 建議該養(yǎng)殖場在仔豬黃痢的治療上選用這4 種作用效果好的藥物,棄用環(huán)丙沙星、卡那霉素、利福平等作用效果不明顯的藥物[4]。

試驗結(jié)束后,在該場的仔豬黃痢防治上,采納了討論部分的建議,防治效果明顯。 大腸桿菌血清型眾多,可引起仔豬多種疾病,所以就出現(xiàn)了防治難的困境。 建議養(yǎng)殖場能明確本場存在的大腸桿菌的血清型,自制疫苗進行預防[5];再找出其高效的抗菌藥,并合理用藥;同時要加強管理。 這樣才能控制大腸桿菌病在場內(nèi)傳染,才能提高仔豬的存活率。