15 種中藥水煎法與乙醇回流提取法體外抑菌試驗比較

南蘋瑤, 蔡紫璇, 周思嘉, 楊 勝, 吳小雪, 王小鶯

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥研究所, 江西 南昌330045)

中藥屬于天然藥物,具有不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小和在畜禽體內(nèi)藥物蓄積量低等優(yōu)勢,因此,用中藥來預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病已成為近些年來的熱點(diǎn)。 目前,已經(jīng)有很多關(guān)于中藥抑菌方面的研究,并且已經(jīng)篩選出許多具有抑菌作用的中藥及有效成分[1～4]。 本試驗研究了醋五味子、石榴皮、千里光、地榆、忍冬花等15 種中藥的水煎提取液和乙醇回流提取液對大腸桿菌的抑菌作用,以便為中藥抗大腸桿菌的發(fā)展和應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 藥材：選用醋五味子、千里光、石榴皮、地榆、石菖蒲、吳茱萸、秦皮、姜厚樸、白頭翁、升麻、忍冬花、馬齒莧、葛根、大青葉、魚腥草15 種中藥,均購自南昌市下羅益豐大藥房。

菌種：大腸埃希菌ATCC25922,購自廣東省微生物菌種保藏中心。

儀器與設(shè)備：粉碎機(jī)(DFT-100,溫嶺市林大機(jī)械有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE5298A,上海亞榮生化儀器廠);循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX-50KBS,上海申安醫(yī)療器械廠);雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2D,蘇州凈化設(shè)備有限公司);生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：取麥康凱瓊脂粉末12.5 g,加入裝有250 mL 蒸餾水的錐形瓶中,加熱煮沸溶解并攪拌,121 ℃高溫滅菌20 min后備用。 未冷卻凝固時分別倒入12 個滅菌干燥的培養(yǎng)皿中,等待瓊脂冷卻凝固。 冷卻后4 ℃冷藏備用。

MH 肉湯培養(yǎng)液：MH 肉湯粉末7.5 g,加入裝有250 mL 蒸餾水的錐形瓶中加熱煮沸溶解并攪拌,121 ℃高溫滅菌20 min 后備用。 冷卻后4 ℃冷藏備用。

1.2.2 菌液的制備 取冷凍保存的塑料凍存管,立即放置在38 ℃～40 ℃水浴中快速復(fù)蘇并適當(dāng)搖動。 直到內(nèi)部結(jié)冰完全溶解為止,一般約50 ～100 s,開啟塑料凍存管,吸取菌液移植于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)18 ～24 h。 挑取該麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單個菌落接種至另一麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行菌種復(fù)蘇。 采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行細(xì)菌計數(shù),勾取平板上菌落1 ～2 個,置于MH 肉湯中,37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。 菌液4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?臨用前稀釋為106CFU/mL。

1.2.3 中藥提取物的制備

1.2.3.1 水煎法 分別稱取所選的15 種中藥粉末4 g,用濾紙包好,1 ∶20 的料液比用蒸餾水浸泡30 min后,加入500 mL 圓底燒瓶內(nèi)塞上瓶口加熱煎煮兩次,每次30 min,收集兩次提取液,濃縮至膏狀物,用蒸餾水以1 g/mL 生藥濃度溶解膏狀物,過濾除菌,4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.3.2 乙醇回流提取法 分別稱取所選的15 種中藥粉末4 g,用濾紙包好,1∶20 的料液比用70%乙醇浸泡30 min 后,加入500 mL 圓底燒瓶內(nèi)回流提取兩次,每次30 min,收集兩次提取液,濃縮至膏狀物,分別用70%乙醇以1 g/mL 生藥濃度溶解,過濾除菌,4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.4 體外抑菌試驗 根據(jù)鳳尾草乙醇提取物體外抑菌試驗的篩選的結(jié)果[5],試管二倍稀釋法中溶劑乙醇對大腸桿菌的MIC 值為6.25%,瓊脂打洞法測定不同濃度梯度的乙醇溶液對大腸桿菌均無抑菌作用,說明在研究中藥提取物的體外抑菌試驗中,用70%乙醇溶解提取物在瓊脂打洞法試驗中不會對結(jié)果造成影響。 因此,為了減少操作,省去以無水乙醇作為對照,選用瓊脂打洞法做體外抑菌試驗,拿滅菌棉簽將制備好的菌液均勻地涂抹在麥康凱瓊脂平板上,室溫干燥5 min,無菌打孔器打孔,以無孔針頭小心挑出孔內(nèi)瓊脂,滴少量未凝固的瓊脂于孔內(nèi)封底,防止藥液從孔內(nèi)流出。 每個孔滴加藥液100 μL,重復(fù)3 次,放置30 min 后,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 ～24 h 后觀察抑菌圈大小,取得平均值并記錄。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 打孔法：抑菌圈直徑＜10 mm為低敏;抑菌圈直徑在10 ～14 mm 為中敏;抑菌圈直徑在15 ～19 mm 為高敏;抑菌圈直徑≧20 mm 為極敏,無抑菌圈為不敏感[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水煎法提取中藥體外抑菌試驗 地榆、千里光、忍冬花、石榴皮、醋五味子水煎法提取物對大腸桿菌均有抑制作用,所測得平均抑菌圈大小分別為7.33 mm、10.67 mm、8.83 mm、6.5 mm、16.17 mm。其中醋五味子對大腸桿菌的抑菌效果最好,為高度敏感,千里光次之,為低度敏感。 其他中藥提取物對大腸桿菌均無抑制作用,根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)為不敏感。 結(jié)果見表1 及圖1。

表1 水煎法及乙醇回流法提取中藥體外抑菌試驗結(jié)果

2.2 乙醇回流法提取中藥體外抑菌試驗 70%乙醇回流提取中藥有效成分對大腸桿菌的抑制作用有所不同,同樣的15 種中藥中醋五味子、石榴皮、大青葉和千里光有抑制作用,所測得的平均抑菌圈直徑分別為24.33 mm、11.67 mm、8.33 mm和6.67 mm,其余中藥提取物對大腸桿菌表現(xiàn)為不敏感。 醋五味子的抑菌作用最強(qiáng),為極度敏感;石榴皮的抑菌作用為中度敏感;大青葉和千里光的抑菌作用較弱,為低度敏感。 結(jié)果見表1 及圖2。

圖1 各中藥水煎法提取物對大腸桿菌的體外抑菌結(jié)果

圖2 各中藥乙醇回流法提取物對大腸桿菌的抗菌的體外抑菌結(jié)果

在本試驗中,15 種中藥分別采用水煎法和乙醇回流法進(jìn)行提取,提取物對大腸桿菌呈現(xiàn)不同程度的抑菌活性。 除醋五味子和石榴皮在兩種提取方法下對大腸桿菌都表現(xiàn)有抑菌作用外,其余具有抑菌作用的中藥都不同,且醋五味子和石榴皮的乙醇回流提取物對大腸桿菌的平均抑菌圈大小分別為24.33 mm、11.67 mm,而它們的水煎法提取物對大腸桿菌的平均抑菌圈大小分別16.17 mm、6.5 mm,乙醇回流法提取中藥的抑菌效果明顯優(yōu)于水煎法。

3 討論

不同中藥的不同提取方法對于大腸桿菌的抑制作用具有差異性,而且對于相同的中藥通過不同的提取方法對于大腸桿菌的抑制作用也是不同的,因此不同的中藥由于其相適應(yīng)的提取方法和工藝。本研究結(jié)果表明,醋五味子和石榴皮的有效成分提取以乙醇回流法比水煎法更優(yōu)。

水煎法是以水為溶劑,中藥材加熱煮沸一定時間從而提取所含成分的一種傳統(tǒng)方法,適用于有效成分能溶于水,相對熱穩(wěn)定性好的中藥。 在本研究中,水煎法提取中藥的抑菌效果不明顯,其原因可能是提取液只包含具有水溶性的成分,比較單一,且水煎法溫度不好控制,導(dǎo)致本身的提取溫度過高,可能破壞了熱穩(wěn)定性較差的成分,使得提取液的抑菌效果減弱;乙醇回流法是用乙醇作為有機(jī)溶劑提取藥物成分,將每次提取液加熱蒸餾,揮發(fā)的溶劑在揮發(fā)后又被冷凝,周而復(fù)始,重復(fù)回流提取液,合并提取液再進(jìn)行濃縮。 此研究中,醋五味子和石榴皮以乙醇回流法制備的提取液抑菌效果較水煎法好,原因可能是提取液中除了水溶性的有效成分外,還有不溶于水的酯類等有效成分的存在。李春遠(yuǎn)從五倍子提取物中分離得出主要的抑菌活性成分為鞣質(zhì)[7],并被證實有中等抑菌活性。

因此,不同的中藥可根據(jù)其有效成分和目標(biāo)產(chǎn)物的不同,來選取最合適的提取方法和提取工藝,并對其工藝進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到最好的提取效果。 研究中藥最優(yōu)的提取方法為進(jìn)一步分離、純化單一抗菌成分的研究做了鋪墊,有待進(jìn)一步研究。