貓源性人葡萄球菌的分離與鑒定

王鵬勇, 高 尚, 王果帥, 張信軍, 鞠輝明, 王彥紅

(1.揚州大學獸醫(yī)學院, 江蘇 揚州225009 ;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚州225009)

人葡萄球菌屬于凝固酶陰性葡萄球菌,是人體的一種正常菌群,只有在機體免疫力低下時才可能引起機體各部位機會性感染,是一種少見的條件致病菌,主要定植于人體皮膚和黏膜表面。 在人上,人葡萄球菌感染具有耐藥率高、慢性反復和難以治愈的特點[1]。 在葡萄球菌菌屬中,人葡萄球菌最顯著的特征是對甲氧西林的高耐藥性,可高達80%以上[2]。 與金黃色葡萄球菌相比,人葡萄球菌缺乏侵襲性毒素和酶類,其致病機制主要是植入動物或人體組織表面形成生物被膜[3]。 隨著抗生素的廣泛應用,葡萄球菌菌屬耐藥性迅速增長的問題已成為全球關注的熱點,特別是人葡萄球菌感染人引起的疾病日益增高,臨床分離率逐漸升高。

近年來,在人體、環(huán)境和蚊子中分離出人葡萄球菌的報道有很多[4-5],也有文獻報道在野生鳥類和牛中分離到本菌[6-7],但并未有報道顯示在貓尿液中分離到本菌。 據(jù)報道,本類細菌對常用抗生素如大環(huán)內酯類、林可酰胺類、萬古霉素類、鏈霉素抗生素有很強的耐藥性[8-9]。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基 綿羊血平板、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。 其中綿羊血,購自杭州天和微生物試劑有限公司;麥康凱瓊脂粉,購自上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司;瓊脂粉與氯化鈉,購自國藥集團化學試劑有限公司。 培養(yǎng)基按通用組方配制。

1.2 主要試劑 本試驗采用的生化培養(yǎng)管和藥敏試紙片,購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 試驗動物 清潔級BALB/cA 小鼠4 只,健康,生長狀況良好,購自揚州大學獸醫(yī)學院比較醫(yī)學中心。

1.4 主要儀器 超凈工作臺(型號為SW - CJ -IL),購自杭州天和微生物試劑有限公司;全自動快速生物質譜檢測系統(tǒng)(型號為Microflex),購自Bruker 公司;恒溫培養(yǎng)箱(型號為GNP9080),購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.5 細菌分離 患貓,雄性,1.5 歲,體重3.5 kg,主訴：有尿閉病史,今出現(xiàn)尿淋漓癥狀,生化結果顯示肌酐、尿素均明顯升高,經(jīng)診斷為泌尿系統(tǒng)感染。對患貓腹部進行剃毛消毒后行膀胱穿刺術,無菌采集患貓尿液,隨后無菌接種于綿羊血平板中,37 ℃下培養(yǎng)24 h,觀察結果。 24 h 后,于綿羊血平板中無菌挑取不同形態(tài)的菌落接種于麥康凱平板中,37 ℃下培養(yǎng)24 h,觀察結果。 無菌挑取單個菌落進行革蘭染色,顯微鏡下觀察。

1.6 生化試驗 采用生化鑒定管(購自杭州天和微生物試劑有限公司,操作方法與判定標準參照該公司操作方法與標準),對分離得到的菌株進行生化指標的鑒定。 在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察結果。

1.7 MALDI biotyper 分析 在無菌操作臺內進行操作,靶板先用無水乙醇清潔,自然干燥。 挑取單個菌落,直接涂抹到MALDI 靶板上,自然干燥。 在單菌落凃層上加入1 μL70%甲酸水溶液,自然干燥。 再加入1 μL 基質溶液,自然干燥后,放入MALDI-TOF(購自Bruker 公司,型號microflex )進行分析,采用flex control 程序進行檢測。

1.8 小鼠攻毒試驗 購自揚州大學獸醫(yī)學院比較醫(yī)學中心的6 周齡小鼠4 只,分為兩組。 一組采用攻毒處理,一組作為對照組。 飼養(yǎng)在高錳酸鉀熏蒸過的舒適保溫環(huán)境中,適應環(huán)境3 d 后,對試驗組接種分離菌。 試驗組中雄鼠采用腹腔注射處理,劑量均1 mL。 對照組雄鼠腹腔注射1 mL 生理鹽水。 給予相同的鼠糧和水源,飼養(yǎng)觀察。

1.9 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法進行藥敏試驗,藥敏片的規(guī)格為多西環(huán)素(30 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、頭孢曲松鈉(30 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、丁胺卡那霉素(30 μg/片)、復方新諾明(23.75 μg/片)、美洛西林(75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、強力霉素(30 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)。 藥敏結果判定按照杭州天和微生物試劑有限公司發(fā)布的標準進行。

2 結果

2.1 細菌分離 將無菌采取的尿液接種無綿羊血平板中,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后,綿羊血平板上長出大量白色菌落,生長狀況良好。 經(jīng)純化培養(yǎng),麥康凱培養(yǎng)基上有菌落生長,但生長狀況不良。 鏡檢如中插彩版圖1,可見為葡萄串樣革蘭陽性球菌。

2.2 生化試驗 將分離純化后的菌落無菌接種于生化鑒定管中,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,觀察微量生化管,并判定結果。 結果見表1,本菌可發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖等。

表1 分離菌生化試驗結果

2.3 MALDI biotyper 分析 MALDI biotyper 分析結果為人葡萄球菌。

2.4 小鼠攻毒試驗 攻毒后24 h,攻毒組和空白組小鼠均未發(fā)生死亡,攻毒組精神不振、不喜活動,空白組精神、食欲均正常;72 h,攻毒組小鼠死亡,空白組精神、食欲均正常。 對死亡小鼠進行剖檢發(fā)現(xiàn),該鼠肝臟充血、出血,呈土黃色,見中插彩版圖2。 取死亡小鼠肝臟組織,無菌接種于綿羊血平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察可見綿羊血平板上有大量白色菌落生長,菌落形態(tài)和分離菌一致。 取肝臟切面作肝臟觸片,革蘭染色后鏡檢,觀察可見大量紫色、葡萄串狀球菌,與分離菌鏡檢一致,見中插彩版圖3。

2.5 藥敏試驗結果 藥敏結果顯示,本菌對新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、美洛西林、慶大霉素、妥布霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、左氧氟沙星、諾氟沙星、鏈霉素極度敏感,結果如表5。

3 討論

分離菌的菌落形態(tài)和生化特性均和人葡萄球菌特性一致,結合MBT 分析可確定分離菌為人葡萄球菌。 在葡萄球菌中,溶血和分解甘露醇是判斷致病性的重要指標[10]。 本株人葡萄球菌能分解甘露醇,加之攻毒回歸試驗的證明,表明人葡萄球菌是該貓患泌尿系統(tǒng)感染的致病菌。

表5 分離菌藥敏試驗結果

人葡萄球菌是存在于皮膚和黏膜的一種正常菌落,屬于機會性細菌,只有在動物機體自身免疫力下降時才有致病性。 本菌對四環(huán)素類抗生素極為敏感,這與曾偉報道的人葡萄球菌對四環(huán)素敏感相符[11]。 葡萄球菌是一類極易產(chǎn)生耐藥性的細菌,隨著抗生素的廣泛應用,葡萄球菌的藥敏結果也不盡相同,因此在臨床治療中最好根據(jù)藥敏結果選用合適的抗生素治療。 這樣不僅可以有效的治療疾病,提高治療效果,更能減少超級細菌的產(chǎn)生。 在本病例中,我們根據(jù)藥敏試驗結果選擇丁胺卡那霉素進行治療,用藥后患貓明顯好轉,10 d 后順利出院。

尿液的細菌培養(yǎng)和藥敏試驗在犬貓泌尿系統(tǒng)感染的治療中起著至關重要的作用,為該病的診斷和治療指明了方向,也提供了科學的依據(jù)。 在等待尿液培養(yǎng)和藥敏結果期間,我們可以先根據(jù)患病動物的臨床癥狀選擇抗菌譜相對較小的經(jīng)驗性一線抗生素以控制感染,緩解動物的不適,如阿莫西林、頭孢氨芐等。 優(yōu)先選擇經(jīng)泌尿道排泄的抗生素。待藥敏試驗結果出來后,根據(jù)藥敏試驗結果調整用藥。 如藥敏結果顯示已使用的抗生素存在耐藥現(xiàn)象,而動物的臨床癥狀在用藥后得到改善,那么我們可以繼續(xù)使用該抗生素;如藥敏結果顯示已使用的抗生素存在耐藥現(xiàn)象,而動物的臨床癥狀在用藥后未得到改善,那么我們可根據(jù)藥敏試驗結果選擇合適的抗生素繼續(xù)治療。

在動物的飼養(yǎng)管理中,預防遠遠大于治療。 因此我們在日常應把重點放在疾病的預防上,注重寵物日常的基本營養(yǎng)攝入,提高寵物自身的免疫力。