鵝沙門(mén)菌的分離與鑒定

王鵬明, 蔣增海, 宋 浩

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地管理中心, 河南 鄭州450000 ;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 河南 鄭州450046)

沙門(mén)菌是一種革蘭陰性菌,在自然界廣泛分布,同時(shí)也存在于人和其他動(dòng)物腸道內(nèi),是重要的人獸共患病病原之一。 家禽是沙門(mén)菌的重要宿主。沙門(mén)菌不僅可以感染家禽,引起發(fā)病或死亡,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也可以造成禽肉、禽蛋等禽產(chǎn)品污染,引起食品安全問(wèn)題,威脅人類(lèi)健康。

有研究表明,鼠傷寒沙門(mén)菌在鵝場(chǎng)中的感染比鴨場(chǎng)更普遍,日齡越小感染越嚴(yán)重。 雛鵝感染沙門(mén)菌的死亡率比較高, 兩周齡以?xún)?nèi)的雛鵝致死率可達(dá)15%以上,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%,耐過(guò)雛鵝生長(zhǎng)發(fā)育減緩、間接降低其商品價(jià)值,常常給養(yǎng)鵝戶(hù)帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重影響著我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展[1]。

近年來(lái),全國(guó)各地鵝沙門(mén)菌病的發(fā)生多有報(bào)道。 俞燕等[2]報(bào)道從發(fā)病雛鵝體內(nèi)分離到鼠傷寒沙門(mén)菌與印第安納沙門(mén)菌2 種血清型混合感染,其中鼠傷寒沙門(mén)菌耐3 種藥物,印第安納沙門(mén)菌耐12種藥物。 許英明[3]報(bào)道,雛鵝沙門(mén)菌與大腸桿菌混合感染,藥敏試驗(yàn)表明,對(duì)沙門(mén)菌敏感較多如頭孢噻呋、氟苯尼考、土霉素和磺胺二甲嘧啶,對(duì)大腸桿菌敏感藥物有丁胺卡那霉素、先鋒V 和復(fù)方新諾明等。 金海林[4]報(bào)道吉林某地一養(yǎng)鵝戶(hù),養(yǎng)鵝1 000只,發(fā)病100 只,死亡20 多只,通過(guò)臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室診斷為沙門(mén)菌感染。 為了確定2017 年6 月豫南地區(qū)某養(yǎng)鵝場(chǎng)雛鵝發(fā)病死亡的原因,同時(shí)為該病的診斷與防治提供參考依據(jù),而開(kāi)展本次試驗(yàn)。

1 發(fā)病情況、臨床癥狀和剖檢變化

2017 年6 月,豫南地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng),飼養(yǎng)雛鵝5 000 只,網(wǎng)上飼養(yǎng),同時(shí)結(jié)合地面自由放養(yǎng),其目的是讓這些雛鵝能夠吃掉該養(yǎng)鵝場(chǎng)林地內(nèi)的野草,從1 周齡左右開(kāi)始發(fā)病,表現(xiàn)為采食下降,精神不振,不愿走動(dòng),排出白色稀糞,消瘦,脫水,每天死亡雛鵝約50 ～150 只,持續(xù)時(shí)間達(dá)1 周以上,發(fā)病期間,連續(xù)幾天陰雨天氣,偶爾晴天,一旦下雨,放牧后雛鵝死亡率陡增,使用氟苯尼考、土霉素等治療,效果不理想;剖檢病變?yōu)樾陌ぴ龊?心包與心外膜粘連,表明覆蓋纖維素性物質(zhì),心包液增多,心外膜出血;肝臟表面灰黃色壞死灶,被膜增厚(見(jiàn)中插彩版圖1);氣囊增厚(中插彩版圖2),表面纖維素性物質(zhì)覆蓋;腸道黏膜出血,輸尿管充滿(mǎn)白色尿酸鹽,腎臟腫大、出血,表明覆蓋尿酸鹽,呈花斑腎。 經(jīng)過(guò)臨床癥狀和病理變化,初步診斷為鵝沙門(mén)菌感染。

2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

采集典型病例的心血和肝臟,分別接種于血瓊脂平板,37 ℃恒溫箱,培養(yǎng)24 ～48 h,進(jìn)一步純化傳代2 ～3 次后,接種S. S. 瓊脂平板,進(jìn)一步培養(yǎng)。 在血瓊脂平板生長(zhǎng)為無(wú)色半透明、圓形、邊緣整齊、濕潤(rùn)的大小約為1 ～2 mm 菌落,菌臺(tái)生長(zhǎng)為奶油狀;s. s 瓊脂平板,呈半透明、圓形、光滑、中央為黑色菌落(見(jiàn)中插彩版圖3)。 將分離菌株命名為Yanlin2。

3 染色、鏡檢

挑取分離純化的菌落,革蘭染色,顯微鏡下觀察到分離菌株為革蘭陰性、短桿狀、中等大小(見(jiàn)中插彩版圖4)。

4 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)使用生化微量管,按照生產(chǎn)廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 該分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果表明吲哚試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)為陰性,M. R. 試驗(yàn)為陽(yáng)性,丙二酸鹽利用為陰性,OPNG 試驗(yàn)為陰性,衛(wèi)矛醇試驗(yàn)為陽(yáng)性,尿素酶為陰性,KCN 為陰性,H2S 試驗(yàn)為陽(yáng)性,賴(lài)氨酸脫羧陽(yáng)性,葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,D-甘露醇、D-山梨醇為陽(yáng)性,乳酸發(fā)酵為陰性,符合沙門(mén)菌生化特征,因此鑒定為沙門(mén)菌。

5 PCR 檢測(cè)

用煮沸法提取分離菌株DNA,作為PCR 擴(kuò)增反應(yīng)模板。 按照參考文獻(xiàn)[6]合成1 對(duì)沙門(mén)菌檢測(cè)特異性引物,上游引物Sal1： 5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′,下游 引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。 PCR 體系為25 μL,擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃4 min;94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃10min;4 ℃保存。 擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)1%凝膠電泳檢測(cè),分離菌株與預(yù)期條帶580 bp 左右一致,即為沙門(mén)菌陽(yáng)性。

圖5 分離菌株P(guān)CR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

6 血清型鑒定

采用寧波天潤(rùn)沙門(mén)菌屬診斷血清,通過(guò)玻片凝集法對(duì)沙門(mén)菌進(jìn)行血清型鑒定,以生理鹽水為陰性對(duì)照,具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,最后根據(jù)Kauffmann-White 抗原表檢索沙門(mén)菌分離株的血清型,確定其具體血清型。 血清型鑒定結(jié)果表明,分離菌株沙門(mén)菌屬于B 群,為鼠傷寒沙門(mén)菌。

7 藥敏試驗(yàn)

采取紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),以E. coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株,參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行藥敏結(jié)果判定。 如表1 所示,藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,該分離菌株對(duì)磺胺異噁唑、阿莫西林、氨芐西林、氯霉素、四環(huán)素均耐藥,呈多重耐藥;對(duì)美羅培南、慶大霉素、恩諾沙星、卡那霉素和多黏菌素B 敏感。

8 治療與建議

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn),本次病例診斷一起典型的鵝沙門(mén)菌病,由于連續(xù)下雨天氣,空氣潮濕,溫度變化較大,加上雛鵝放養(yǎng),帶菌鵝或者病鵝排出病菌,污染土壤或者泥土里污水,被健康鵝飲用后,可能導(dǎo)致沙門(mén)菌感染而發(fā)病。 藥敏試驗(yàn)表明,對(duì)氯霉素、四環(huán)素、磺胺類(lèi)藥物、氨芐西林和阿莫西林等均耐藥;對(duì)恩諾沙星(喹諾酮類(lèi)藥物)、慶大霉素(氨基糖甙類(lèi)藥物)等敏感。 我們建議養(yǎng)殖戶(hù)選擇安普霉素和環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥,將藥物兌水中飲用,連用3 ～5 d;同時(shí),禁止雛鵝放養(yǎng),圈舍內(nèi)沖洗,嚴(yán)格消毒。 1 周以后,基本沒(méi)有雛鵝死亡,疫情得到控制。 因此,雛鵝患沙門(mén)菌病后,采集病料、分離細(xì)菌,進(jìn)行藥敏試驗(yàn),篩選敏感藥物用于臨床治療,對(duì)控制該病十分重要。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

沙門(mén)菌在自然界中十分普遍,是一種條件致病菌,甚至健康鵝的消化道、呼吸道中,都存在有本菌,當(dāng)營(yíng)養(yǎng)不良、氣候突變、飼料更換、鵝舍潮濕、連續(xù)陰雨天氣、長(zhǎng)途運(yùn)輸、受涼和發(fā)生其他疾病等因素,機(jī)體抵抗力下降時(shí)這些病菌迅速繁殖,侵入機(jī)體引起發(fā)病。 養(yǎng)鵝農(nóng)戶(hù)應(yīng)該引起重視,特別是雛鵝階段。 因此,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理是防治本病的有效方法。