一起商品肉雞傳染性囊病病毒大腸桿菌混合感染的診治

孫月萍, 牟澤華, 劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院, 山東 青島266109)

隨著商品肉雞養(yǎng)殖集約化程度的提高,大部分規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖場的免疫程序比較完善。 病毒病的大規(guī)模暴發(fā)鮮有發(fā)生。 最近某商品肉雞養(yǎng)殖場出現(xiàn)23 日齡肉雞的急性死亡,病雞剖檢可見腔上囊腫脹,有的腔上囊底部出血,氣囊渾濁,心包積液,絕大部分雞可見肝、脾腫大,個別雞出現(xiàn)腿肌出血病變,初步懷疑為細菌和病毒的混合感染。 分別通過細菌學和病毒學兩個方面的鑒定,判定該起疫情為傳染性囊病病毒與大腸桿菌混合感染所致。 檢測過程及治療情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 檢測樣品為某商品肉雞養(yǎng)殖場送檢的大批死亡或瀕死的23 日齡肉雞。 試驗所用培養(yǎng)基為青島海博生物技術公司產(chǎn)品;藥敏紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品;PCR 試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;大腸桿菌單因子標準陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所; 質(zhì)控菌株ATCC25922,購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 細菌的分離鑒定

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 無菌取發(fā)病雞肝、脾分別劃線接種普通培養(yǎng)基、S. S. 培養(yǎng)基和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基進行37 ℃培養(yǎng)。 將生長的單菌落進一步接種血瓊脂平板培養(yǎng)觀察。

1.2.2 大腸桿菌的PCR 鑒定 常規(guī)分離培養(yǎng)不能完全確診是大腸桿菌,因此,又對分離細菌進行了PCR 鑒定。 采用煮沸法提取待檢細菌DNA 作為PCR 擴增模板[1]。 根據(jù)文獻報道的大腸桿菌的usp A 基因PCR 鑒定方法[2],利用上游引物5′ -CCGATACGCTGCCAATCAGT -3′和下游引物5′ -ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3′按常規(guī)PCR 擴增體系和循環(huán)對待檢菌進行了PCR 擴增。

1.2.3 血清型鑒定 用購買的大腸桿菌單因子標準陽性血清與高壓處理過的分離菌株的菌體抗原進行凝集反應[3]。

1.2.4 藥敏試驗 將鑒定的大腸桿菌按常規(guī)方法進行18 種藥物的紙片法藥敏試驗,同時設大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922 作為對照,根據(jù)美國NCCLS藥敏試驗標準判定藥物的敏感性。

1.3 病毒的分離鑒定 根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變,懷疑有傳染性囊病病毒(IBDV)感染,通過RT-PCR進行病毒檢測。 取病死雞腫脹腔上囊用剪刀剪碎后進行充分研磨。 制成1∶10 組織懸液。離心取上清液按羅氏試劑盒說明書提取RNA。 提取RNA 作為模板,以5′ - TCACCGTCCTCAGCTTAC - 3′為上游引物,5′ - TCAGGATTTGGGATCAGC-3′為下游引物進行一步法RT - PCR 擴增IBDV 的VP2 基因片段。 將擴增產(chǎn)物送往派森諾生物工程有限公司測序,測序結果在GenBank 上進行Blast 比對。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果 普通培養(yǎng)基長出無色透明光滑菌落,S. S. 培養(yǎng)基形成紅色菌落,大腸桿菌顯色培養(yǎng)基形成藍色菌落。 挑取單菌落接種血平板出現(xiàn)β 溶血現(xiàn)象。 革蘭染色顯示為兩端鈍圓的革蘭陰性桿菌。 根據(jù)培養(yǎng)特性判定分離細菌疑似大腸桿菌。

2.2 PCR 方法鑒定大腸桿菌 大腸桿菌usp A 特異基因的PCR 擴增獲得了與預期大小相符的860 bp擴增條帶(圖1)。 結合鑒別培養(yǎng)基的生長特性可確定待檢細菌為大腸桿菌。

2.3 血清型鑒定 大腸桿菌單因子陽性血清凝集試驗將大腸桿菌分離株血清型鑒定為O35。

2.4 藥敏試驗 紙片法藥敏試驗結果表明,質(zhì)控菌株ATCC25922 的藥敏結果完全符合要求。 大腸桿菌分離株的敏感藥物有：硫酸慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林、磷霉素鈣、頭孢曲松鈉。

圖1 大腸桿菌usp A 基因的PCR 擴增結果

3 病毒的分離鑒定

通過瓊脂糖凝膠電泳觀察,RT -PCR 結果獲得了與預期大小相符的640 bp 的擴增條帶(圖2)。

圖2 IBDV 的VP2 基因的RT-PCR 擴增結果

擴增產(chǎn)物測序結果在GenBank 上進行Blast 比對,結果表明,本試驗毒株所測VP2 序列與IBDV 毒株同源性達97%上,所以確認本次鑒定毒株為IBDV。 將所測IBDV 的VP2 序列與該雞場使用的IBDV 疫苗株B87 株、經(jīng)典強毒株、超強毒株、變異株進行同源性比對。 由圖3 結果可知,本試驗鑒定毒株除與GenBank 提交的IBDV 分離株FJ719018. 1同源性達到97.4%,與本雞場使用的疫苗株同源性為39.7%,說明本次IBDV 感染為野毒感染。

4 治療

根據(jù)篩選的敏感藥物,結合藥物配伍原則,選擇阿米卡星與阿莫西林進行聯(lián)合用藥。 同時對發(fā)病雞舍全群皮下注射IBDV 高免卵黃抗體2 mL/只,該雞場在用藥與抗體后1 d,即控制了發(fā)病雞群的死亡,連續(xù)用藥與抗體3 d,基本控制了疫情,發(fā)病雞群開始恢復正常。

圖3 待測腔上囊樣品與B87 疫苗株的VP2基因序列的同源性比較

5 討論與分析

IBD 的發(fā)病特點是發(fā)病突然,死亡率高,所以一旦發(fā)生該病,造成的經(jīng)濟損失是巨大的。 在規(guī)模化肉雞養(yǎng)殖中,預防IBD 的發(fā)生通常采用疫苗接種的方式,只不過不同養(yǎng)殖場選擇的疫苗和免疫日齡不同,多數(shù)養(yǎng)殖場采用14 日齡左右進行活苗飲水免疫,目前也有一些養(yǎng)殖場選擇在孵化場進行1 日齡注射免疫,所用疫苗主要是一些新型IBD 疫苗,如梅里亞的威立克(將IBDV 的VP2 基因插入HVT 構建的重組疫苗)[4]、法國詩華的囊胚寶和美國輝瑞的安囊寶(均屬于抗原抗體復合物)等。 本試驗中的發(fā)病雞場采取的是14 日齡IBD 中等毒力活疫苗(B87 株)飲水免疫,但仍然在23 日齡出現(xiàn)2 棟雞舍發(fā)病,究其原因很可能與潛伏感染、免疫不均勻或漏免有關。 從與IBDV 的其他經(jīng)典毒株的同源性比對結果來看,本試驗測序毒株為不同于經(jīng)典強毒株、超強毒株、變異株的野毒,其生物學特性和基因特性有待進一步研究。

大腸桿菌血清型種類繁多,雞源致病性大腸桿菌的傳統(tǒng)血清型有O1、O2、O26、O78等,但不同地區(qū)分離的優(yōu)勢血清型不同[5]。 劉香敏等分離的大腸桿菌的主要血清型為O14、O35、O1、O2等[6];本試驗分離的大腸桿菌血清型為O35,并非傳統(tǒng)優(yōu)勢血清型,而是近年來常見流行血清型。

IBD 使用抗體進行緊急預防和治療效果顯著,所以發(fā)病雞場在采用抗體和敏感藥物后收到了立竿見影的效果。