兔宿主防御肽RSRAH 的穩(wěn)定性和抗感染保護(hù)作用研究

李曉芬, 王毅東, 張志強, 高啟紅, 陳麗娟, 陳紅偉

(西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院, 重慶 榮昌402460)

宿主防御肽(Host defense peptides,HDPs),也稱之為抗微生物肽(Antimicrobial peptides,AMPs),再起初稱之為抗菌肽(Antibacterial peptides),隨后研究發(fā)現(xiàn)有些“抗菌肽”還可以抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲等,故改稱抗微生物肽。 由于AMPs 往往是真核生物的先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分,因此很多學(xué)者又將其稱為宿主防御肽[3]。 HDPs 具有廣譜的抗微生物活性和非特異性作用機制,因此,被視為克服臨床獲得性耐藥的有效替代方法[2]。

家兔圓小囊(sacculu srotundus)是具有豐富淋巴樣組織的部位,是兔特有的一個集消化、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌為一體的多功能器官,是兔特有的腸道相關(guān)性淋巴組織[4]。 相關(guān)文獻(xiàn)研究表明,在兔圓小囊組織中發(fā)現(xiàn)有大量抗菌肽類物質(zhì)存在[5],后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)屬于NP2 防御素[4]。 我們參考王可洲[4]的分離提取方法,調(diào)整改進(jìn)后采用“機械破碎+乙酸浸提+分子篩層析+離子交換”法分離純化,并經(jīng)NanoLC-ESI-MS/MS 分析鑒定結(jié)合生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中的抗菌活性物為一種組蛋白H2bc 類似物,由于來源于兔圓小囊,所以簡稱為RSRAH(Rabbit Sacculus Rotundus Antimicrobial Histone)[6]。 本試驗為了進(jìn)一步研究該HDPs 的性質(zhì)和功能,特開展了其穩(wěn)定性和抗感染保護(hù)作用研究,報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑及實驗動物 中性蛋白酶等：北京索萊寶科技有限公司;頭孢噻呋鈉凍干粉：齊魯動物保健品有限公司等。 大腸桿菌(ATCC 25922)等菌株：由西南大學(xué)獸醫(yī)工程技術(shù)研究中心提供。

抗菌肽RSRAH 的制備和純化：取家兔圓小囊組織,采用乙酸粗提,經(jīng)硫酸銨沉淀法去除雜蛋白,用AKATA 蛋白純化系統(tǒng)和分子篩Sepharose 4FF、陰離子交換填料Qsepharose HP 進(jìn)一步去雜蛋白,將該電泳純蛋白冷凍干燥后于-20 ℃保存?zhèn)溆肹6],臨用時用滅菌生理鹽水配制成不同濃度的受試液。

清潔級KM 小鼠(體重相近、健康的斷奶小鼠)：由西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備 AKTAPRIMER.Plus 型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)(通用電氣醫(yī)療集團(tuán));菲恰爾GL -12A高速冷凍離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)等。

1.3 不同理化因素對RSRAH 的抗菌活性的影響

1.3.1 溫度對RSRAH 的抗菌活性影響 將RSRAH 分別置于50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃水浴中加熱10 min,以金黃色葡萄球菌(CVC1882)和大腸桿菌(ATCC25922)標(biāo)準(zhǔn)菌株為受試菌,以室溫(25 ℃)為對照,采用“瓊脂糖彌散法”測定其抑菌效果。 每個處理設(shè)6 次重復(fù)。

1.3.2 反復(fù)凍溶對RSRAH 抗菌活性的影響 將RSRAH 分別反復(fù)凍融1、2、4、6、8、10 次,以未經(jīng)凍融處理的樣品作為對照。 體外抗菌活性試驗同1.3.1。

1.3.3 不同蛋白酶對RSRAH 抗菌活性的影響

37 ℃水浴條件下,用反應(yīng)濃度均為1 mg/mL 的中性蛋白酶(Neutral protease)、胃蛋白酶(Pepsase)、胰蛋白酶(Trypsase)分別處理RSRAH 30 min,以不加酶處理的為對照。 體外抗菌活性試驗同1.3.1。

1.4 最小致死菌量(MLD)試驗 將50 只小鼠,隨機分為5 組,每組10 只,設(shè)4 個不同濃度的菌液。 將平皿上的增毒后的大腸桿菌(84-1)臨床株接種于營養(yǎng)肉湯中37 ℃孵育18 h,用無菌水稀釋為4 個濃度,分別進(jìn)行小鼠腹腔注射,每只0.5 mL,并在2 h 內(nèi)對稀釋菌液用傾注平板法進(jìn)行菌落計數(shù),感染后觀察記錄小鼠死亡數(shù),陽性對照組應(yīng)具有90%以上的死亡率,陰性對照組應(yīng)具有10%以下的死亡率,否則繼續(xù)摸索適宜的MLD。 得到最低致死菌液濃度后,對其進(jìn)行菌落計數(shù)以得出最小致死菌量(MLD)[7]。

1.5 對小鼠急性感染的相對保護(hù)率試驗 將100只小鼠,按體重隨機分為5 個處理組：RSRAH 高(38 mg/kg)、中(19 mg/kg)、低劑量組(9.5 mg/kg)、頭孢噻呋鈉組( 15.2 mg/kg)、生理鹽水對照組。 每個處理組20 只小鼠,各組小鼠均按0.2 mL/10 g·bw 腹腔注射受試液,空白組給予生理鹽水,30 min 后每只小鼠腹腔注射0.5 mL 1 倍MLD 的大腸桿菌菌液,隨后每6 h 記錄死亡情況,得出注射細(xì)菌后72 h 存活率,測定各組相對保護(hù)率(Relative percent survival,RPS)。 RPS = [1 - (試驗組死亡率/對照組死亡率)] ×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件,統(tǒng)計數(shù)據(jù)以x±s 表示,采用One Way ANOVA 分析,并用Duncan 比較各數(shù)據(jù)間的差異。 P ＜0.05 視為兩組數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同理化因素對RSRAH 抗菌活性的影響 與對照組相比較,經(jīng)不同溫度和反復(fù)凍溶處理后的該抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果無顯著變化(P ＞0.05);經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后該抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果極顯著降低(P ＜0.01),中性蛋白酶處理后對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著降低(P ＜0.05)。 結(jié)果見圖1 ～3。

圖1 不同溫度對RSRAH 抗菌活性的影響

圖2 反復(fù)凍融對RSRAH 抗菌活性的影響

圖3 不同蛋白酶對RSRAH 抗菌活性的影響

2.2 MLD 及RPS 結(jié)果 經(jīng)試驗,該大腸桿菌(84 -1 臨床分離菌株)的最小致死菌量(MLD)為5.5 ×108CFU/mL。

72 h 相對保護(hù)率(RPS)分別為：H -RSRAH 組70%,M - RSRAH 組40%,L - RSRAH 組20%,頭孢噻呋鈉(EFT)組80%。 72 小時內(nèi)不同時間的小鼠死亡率見圖4。

3 討論

圖4 72 h 內(nèi)不同時間的小鼠累積死亡率(N=20)

前期研究發(fā)現(xiàn),RSRAH 能改善免疫功能低下小鼠的生長性能、提高免疫器官指數(shù),促進(jìn)小鼠血液中IFN-γ,IL-4 的產(chǎn)生,促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖,對免疫低下小鼠的細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用[8]。隨后開展了RSRAH 基因的時空表達(dá)特性和內(nèi)源性表達(dá)調(diào)控等研究,推斷RSRAH 是家兔先天性免疫的重要組成成分(有關(guān)結(jié)果將另文發(fā)表),因此將其改稱為宿主防御肽(HDPs)。 在關(guān)于HDPs/ AMPs的穩(wěn)定性研究報道中,大部分HDPs 具有熱穩(wěn)定性,在100 ℃下加熱10 ～15 min 仍能保持其活性,如馬衛(wèi)明[10]等報道從豬腸道上提取的一種抗菌肽能夠在高溫、反復(fù)凍融、不同的有機溶劑等條件下均具有穩(wěn)定的生物活性。 此外,部分HDPs 尚具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力[11]。 本試驗發(fā)現(xiàn),RSRAH 具有熱穩(wěn)定、反復(fù)凍融穩(wěn)定和蛋白酶作用不穩(wěn)定的特性,但值得注意的是該3 項研究內(nèi)容的對照組(25 ℃、0 次凍融、生理鹽水處理)間的抑菌圈大小存在著一定差異,初步分析是由于3 項研究內(nèi)容是完全獨立先后開展的,可能與營養(yǎng)瓊脂來源不同或傳代的細(xì)菌的代次不同有關(guān),是否存在抗菌作用的不穩(wěn)定性還有待進(jìn)一步考察。

另外,通過測定臨床分離的大腸桿菌(84 -1)的最小致死菌量(MLD)來建立小鼠急性感染模型,發(fā)現(xiàn)造模6 h 后生理鹽水對照組的死亡率為20%,RSRAH 的中、高劑量組均未出現(xiàn)死亡。 造模18 h后生理鹽水對照組的累積死亡率達(dá)50%,進(jìn)入快速死亡期,而RSRAH 的中、高劑量組的累積死亡率僅為10%。 而造模48 h 后生理鹽水對照組的累積死亡率達(dá)100%, RSRAH 的中、高劑量組的死亡率分別為60%和30%,且后續(xù)觀察時間內(nèi)未再出現(xiàn)死亡。 當(dāng)觀察到連續(xù)兩個時間點的所有試驗組死亡率均不再變化作為最終觀察時間,即72 h。 通過計算,得出72 h 的相對保護(hù)率(RPS),頭孢噻呋鈉對照組為80%,RSRAH 高劑量組為70%,中劑量組為40%,低劑量組為20%。 試驗結(jié)果表明,宿主防御肽RSRAH 對小鼠急性感染具有抗感染保護(hù)作用,并呈現(xiàn)典型的劑量依賴性。