豬流行性腹瀉病毒與產(chǎn)硫化氫大腸桿菌混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

劉 京, 趙 雪, 王云霄, 徐瑞濤, 宋勤葉, 李潭清, 高玉紅

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 河北省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心, 河北 保定071000 ;2. 保定市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心, 河北 保定071001 ;3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 河北 保定071000)

豬流行性腹瀉病毒( PEDV)和大腸桿菌是初生仔豬腹瀉死亡的兩個(gè)重要病原[1]。 PEDV 引起的豬流行性腹瀉是一種高度接觸傳染性腸道傳染病,以腹瀉、嘔吐、脫水為主要臨床癥狀,冬季多發(fā),各種年齡的豬均易感,其中以7 ～10 日齡內(nèi)的哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重。 大腸桿菌可以感染所有生長(zhǎng)階段的豬,但對(duì)哺乳仔豬和剛斷奶仔豬的危害最為嚴(yán)重。 豬大腸桿菌病主要包括仔豬黃痢、白痢、水腫病和斷奶仔豬腹瀉等類(lèi)型,其中仔豬黃痢是導(dǎo)致7 日齡內(nèi)仔豬死亡的重要原因之一。 2010 年冬季以來(lái),PEDV 變異株在國(guó)內(nèi)外豬場(chǎng)暴發(fā)流行,引起仔豬嘔吐、腹瀉和脫水,7 ～10 日齡內(nèi)的仔豬發(fā)病率90% ～100%,死亡率高達(dá)90%以上,給養(yǎng)豬場(chǎng)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。 我們實(shí)驗(yàn)室對(duì)近年臨床腹瀉病例的病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),以PEDV和大腸桿菌混合感染非常普遍。 這兩種病原的混合感染,導(dǎo)致病情加重,死亡率增高,顯著加重了豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

本文對(duì)河北保定某豬場(chǎng)初生仔豬腹瀉病例進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷,旨在明確引起該豬場(chǎng)腹瀉的病因,為疫病的及時(shí)有效防治提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為仔豬腹瀉的病因分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 2017 年4 月河北保定某豬場(chǎng),仔豬初生后2 ～3 日齡開(kāi)始嘔吐、拉黃色或水樣稀便,病豬被毛粗亂,迅速脫水、衰弱、死亡,發(fā)病率80% ～100%,死亡率70% ～90%以上,嚴(yán)重的整窩死亡。 剖檢可見(jiàn),小腸脹滿,腸內(nèi)容物呈黃色水樣稀便,腸壁菲薄,腸系膜淋巴結(jié)出血、水腫;腹股溝淋巴結(jié)出血。 用氟哌酸、鏈霉素和慶大霉素等抗生素治療效果不明顯。 無(wú)菌采取病死豬的肝臟、脾臟、小腸等用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 ～8 周齡健康BALB/c 小鼠12只,購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.3 培養(yǎng)基 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂或肉湯、麥康凱、伊紅美蘭等培養(yǎng)基,購(gòu)自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司;腸桿菌科細(xì)菌微量生化鑒定管,抗菌藥物敏感性試驗(yàn)用紙片,購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 RNA 提取試劑盒與2 ×Taq Master Mix,購(gòu)自北京康為生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV,為Promega 公司產(chǎn)品;RNA 酶抑制劑,購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司;隨機(jī)引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 病毒的RT-PCR 檢測(cè) 根據(jù)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬A 群輪狀病毒(RVAV)的已知核酸序列,參考文獻(xiàn)[3]合成檢測(cè)這3 種病毒核酸的特異引物(表1)。 采取病死豬小腸及其內(nèi)容物剪碎、研磨、凍融后,在4 ℃下以8 000 r/min 離心10 min;取上清液,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行PCR 檢測(cè)。 PCR 反應(yīng)體系為：cDNA 模板2 μL,2 ×Taq Master Mix 20 μL,上、下游引物各1 μL,無(wú)菌三蒸水16 μL;反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃3 min,94 ℃45 s,退火55 ℃30 s,延伸72 ℃45 s,共35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃終延伸10 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)PCR 產(chǎn)物,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定與分析。 測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 PCR 檢測(cè)病毒核酸用引物

1.6 細(xì)菌的分離純化 取肝臟、脾臟等組織分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)18 ～24 h后,觀察菌落的形態(tài)特征,挑取單個(gè)菌落革蘭染色,顯微鏡檢查細(xì)菌的染色與形態(tài)特征。 挑取單個(gè)菌落接種到麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂平板鑒別培養(yǎng)基上,進(jìn)一步培養(yǎng),觀察細(xì)菌的培養(yǎng)特性。

1.7 細(xì)菌的鑒定

1.7.1 細(xì)菌生化特性鑒定 取純化的菌落接種到腸桿菌科細(xì)菌微量生化鑒定管,37 ℃培養(yǎng)24 ～48 h,觀察并記錄結(jié)果。 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.7.2 16S rRNA 基因序列的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因序列設(shè)計(jì)通用引物16S F∶5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′,16S R ∶5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′。 取純化的菌液PCR。 PCR 反應(yīng)體系為：菌液2 μL,2×Taq Master Mix 20 μL,上、下游引物各1 μL,無(wú)菌三蒸水16 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃3 min,94 ℃45 s,退火52 ℃1 min,延伸72 ℃1 min,共35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃終延伸10 min。 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)PCR 產(chǎn)物,并純化回收目的核苷酸片段,對(duì)目的核苷酸進(jìn)行序列測(cè)定與分析。 測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.8 致病性試驗(yàn) 將12 只8 周齡 的BALB/c 小鼠,隨機(jī)分為感染組(n=8)和對(duì)照組(n =4)。 將培養(yǎng)20 h 的純化菌液經(jīng)腹腔注射給實(shí)驗(yàn)小鼠,每只感染1.06 ×108個(gè)菌,對(duì)照組以同樣途徑接種營(yíng)養(yǎng)肉湯0.2 mL/只。 感染后每隔2 h 觀察1 次,記錄小鼠發(fā)病和死亡情況,并取死亡小鼠的肝、脾和腎等組織進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.9 藥敏試驗(yàn) 采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。 取大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物,均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂板表面,待菌液吸附后,貼上藥敏紙片,于37 ℃培養(yǎng)18 h ～24 h,觀察結(jié)果,測(cè)量抑菌圈直徑。 按照杭州天和微生物試劑有限公司對(duì)藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn),判斷分離菌對(duì)試驗(yàn)用藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 病毒的RT-PCR 結(jié)果與序列比對(duì) 從病死豬小腸及其內(nèi)容物中擴(kuò)增到了預(yù)期大小(316 bp)PEDV 核衣殼(N)蛋白基因片段(圖1)。 對(duì)擴(kuò)增片段的序列測(cè)定結(jié)果顯示,該核苷酸序列與2010 年以來(lái)國(guó)內(nèi)外流行毒株相應(yīng)核苷酸片段的同源性為99%以上,與之前PEDV 代表株CV777 的同源性為93.67%。 表明此病例中檢出的PEDV 為當(dāng)前流行的PEDV 變異強(qiáng)毒株。 在病料中沒(méi)有擴(kuò)增到TGEV和RVA 的核苷酸片段。

2.2 分離菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征 從病死豬的肝臟和脾臟中均分離到了細(xì)菌,細(xì)菌在普通培養(yǎng)基、血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好,菌落呈灰白色、圓形、凸起、濕潤(rùn)、邊緣整齊;在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上形成有金屬光澤的黑紫色菌落,在麥康凱培養(yǎng)基長(zhǎng)成紅色菌落(見(jiàn)中插彩版圖2A)。 取分離菌涂片、鏡檢,可見(jiàn)革蘭染色陰性、兩端鈍圓的桿狀菌(見(jiàn)中插彩版圖2 B)。

圖1 PEDV 核衣殼(N)蛋白基因片段的RT-PCR 產(chǎn)物

2.3 分離菌的生化特性 分離菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、棉子糖、山梨醇,不發(fā)酵側(cè)金盞花醇。 靛基質(zhì)、甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。 V-P 試驗(yàn)陰性,不利用枸櫞酸鹽,能利用葡萄糖酸鹽。 產(chǎn)生H2S,不分解尿素。 賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性,苯丙氨酸脫氫酶陰性(表2)。 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,分離株的上述生化反應(yīng)結(jié)果符合大腸桿菌的生化特性。

表2 分離菌的生化特性

2.4 分離菌16S rRNA 基因序列分析 取純化的菌液,應(yīng)用16S rRNA 基因序列特異引物,經(jīng)PCR 可以擴(kuò)增到預(yù)期大小的核酸產(chǎn)物(圖3)。 經(jīng)過(guò)測(cè)序與序列比對(duì)分析可知,目的核酸序列全長(zhǎng)1 502 bp(Gen-Bank 登錄號(hào)：MG356453),與GenBank 中公布的已知大腸桿菌16S rRNA 基因序列的同源性高達(dá)99.9%。 根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示,該大腸桿菌與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC,MF919609)處于同一分支(圖4)。

2.5 分離菌的致病性 腹腔接種分離菌2 h 后,感染組的小鼠表現(xiàn)精神沉郁、反應(yīng)遲鈍、動(dòng)作緩慢、皮毛松亂等癥狀。 感染后5 h 死亡2 只,6 h ～16 h內(nèi)又陸續(xù)死亡5 只,至感染后20 h,最后1 只死亡,死亡率100%(圖5)。 取病死小鼠的肝臟、脾臟和腎臟涂片,革蘭染色后,顯微鏡下可見(jiàn)革蘭陰性桿菌,并可分離鑒定到大腸桿菌。 試驗(yàn)期間陰性對(duì)照小鼠正常。

圖3 分離菌16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.6 分離菌的藥物敏感性 在測(cè)定的15 種藥物中,分離菌株僅僅對(duì)多黏菌素B 敏感,對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松鈉和呋喃妥因中介,對(duì)頭孢拉定、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮以及多種氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥(表3)。

圖4 基于細(xì)菌16S rRNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 感染分離菌后小鼠的死亡動(dòng)態(tài)

3 討論

本試驗(yàn)中,首先根據(jù)疫情主要危害初生仔豬,發(fā)病率和死亡率高,病豬嘔吐、腹瀉及剖檢病變,初步認(rèn)為該疫情是由傳染性因素引起的腹瀉,進(jìn)而從病毒和細(xì)菌兩方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷。 鑒于PEDV、TGEV和RVAV 是引起 仔豬腹瀉的常見(jiàn)病毒,本試驗(yàn)首先應(yīng)用RT-PCR 檢測(cè)了這3 種病毒,結(jié)果從病死豬小腸及其內(nèi)容物內(nèi)只檢測(cè)到了PEDV 核酸,進(jìn)一步序列分析表明,檢測(cè)到的核酸序列與當(dāng)前流行的PEDV 變異株的同源性高達(dá)99%以上,而與2010 年之前流行的以CV777 為代表的毒株同源性較低(93.67%)。 該結(jié)果說(shuō)明PEDV 變異株是引起該豬場(chǎng)仔豬腹瀉的主要原因。 考慮到大腸桿菌是早期仔豬腹瀉的常見(jiàn)致病菌,并且臨床上常出現(xiàn)PEDV 與大腸桿菌混合感染的病例[4-7],因此我們對(duì)病例進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)診斷,以便明確該疫情是否為PEDV 與其他細(xì)菌混合感染所致。 結(jié)果從病死仔豬的肝臟和脾臟中均分離到了細(xì)菌,該分離菌的染色、形態(tài)特征、培養(yǎng)特性以及生化特性均與常見(jiàn)的大腸桿菌相符。 感染分離菌的小鼠很快出現(xiàn)臨床癥狀,感染后5 h 開(kāi)始死亡,在20 h 內(nèi)100%死亡,表明該大腸桿菌具有很強(qiáng)的致病性,其與PEDV 混合感染加劇了病情。 但值得注意的是,大腸桿菌通常不產(chǎn)生H2S,多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的豬源大腸桿菌通常為H2S 陰性[7-8]。 本研究分離到的大腸桿菌產(chǎn)生H2S,此結(jié)果與江智輝等(1988)和張文波等(2013)[9-10]報(bào)道的分別從患仔豬白痢糞便和腸脹氣母豬腸內(nèi)分離到H2S 陽(yáng)性大腸桿菌的結(jié)果一致。 此外,已有多篇從腹瀉病人糞便中分離到H2S 陽(yáng)性大腸桿菌的報(bào)道,并且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)H2S 大腸桿菌在醫(yī)學(xué)微生物領(lǐng)域有逐漸增多的趨勢(shì)[11-12]。 我們此次從發(fā)病豬場(chǎng)分離到致病性H2S 陽(yáng)性大腸桿菌,提示該類(lèi)菌株很有可能在動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)的流行逐漸增多,需加以關(guān)注。

表3 分離菌株的藥物敏感性

基于細(xì)菌16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明,分離菌與產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的親緣關(guān)系最近,提示分離菌可能為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌,對(duì)此需要進(jìn)一步毒素試驗(yàn)證明。 此外,藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,該大腸桿菌除了對(duì)多黏菌素B 敏感外,對(duì)多種頭孢菌素、氨基糖苷類(lèi)藥物、喹諾酮類(lèi)以及強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明等臨床常用藥物中介或耐藥。 此結(jié)果提示,當(dāng)前豬場(chǎng)大腸桿菌的耐藥性已相當(dāng)普遍,應(yīng)該引起養(yǎng)殖人員、臨床獸醫(yī)和相關(guān)部門(mén)的高度重視。