人參皂苷Rb1 對PRRSV 的體外抑制作用及對病毒N 蛋白表達(dá)的影響

孫 娜, 楊 慧, 趙 昕, 尹 偉, 范闊海, 孫耀貴, 李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 山西 太谷030801)

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的豬高度接觸性傳染病。 據(jù)哈獸維科技術(shù)服務(wù)部檢測實(shí)驗(yàn)室2017年疾病檢測報(bào)告顯示,全國24 個省市325 個豬場的1 079 份病料樣品和425 份糞便或腸道組織樣品中,PRRSV 的陽性檢出率為27.17%,僅次于豬流行性腹瀉病毒(40.94%)和豬圓環(huán)病毒2 型(27.84%)。由于病毒的廣泛傳播、持續(xù)感染以及活疫苗的大量使用,PRRSV 的毒株變異越來越快,給全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展和食品安全帶來巨大的挑戰(zhàn)[1-3]。 2006 年,我國大范圍暴發(fā)了高致病性PRRS,波及全國25 個省份,撲殺近200 萬頭生豬,生豬存欄量驟降2/3,養(yǎng)豬業(yè)損失慘重[4]。 2013 年,PRRSV NADC30-like 毒株的出現(xiàn),使PRRS 再次流行起來[5]。 現(xiàn)階段尋求快速、低價(jià)、穩(wěn)定控制病毒性疾病的方法和藥物已成為研究熱點(diǎn)。 臨床上中藥治療病毒病不僅能直接殺滅病毒,還能通過增強(qiáng)機(jī)體免疫能力,調(diào)動機(jī)體的各個免疫防御系統(tǒng)來發(fā)揮抗病毒作用,因此,中藥治療病毒病已受到廣泛關(guān)注。

人參皂苷是人參的主要藥效成分,其中二醇型人參皂苷Rb1(GSR1)和三醇型人參皂苷Rg1 的含量最高,近年來研究最多[6]。 GSR1 作用廣泛,可以抑制炎癥[7],抑制細(xì)胞凋亡[8],誘導(dǎo)感染單純皰疹病毒(HSV)的細(xì)胞內(nèi)免疫因子的活化[9],還可通過保護(hù)感染HIV-1 大腦中的神經(jīng)元發(fā)揮抗HIV-1 作用[10],但其對PRRSV 的抑制作用及對PRRSV 核衣殼蛋白(N)表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。 本試驗(yàn)通過PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞模型,研究GSR1 抗PRRSV 作用及其可能作用方式,并檢測其對病毒核衣殼蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清,購自Hyclone公司;熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自寶生物工程(大連)有限公司;DMSO 分析純級,購自美國Sigma 公司;總蛋白提取試劑盒,購自北京普利萊基因公司;山羊抗小鼠IgG、抗β-Actin 鼠單克隆抗體、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒,購自北京康為世紀(jì)生物科技公司;TRIZol,購自美國Invitrogen 公司;DAPI 染色試劑盒,購自南京凱基生物公司;羊抗鼠IgG/FITC,購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。 N基因重組質(zhì)粒由本試驗(yàn)室制備。

1.2 藥物、細(xì)胞與病毒 人參皂苷Rb1 單體樣品,購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司;人參皂苷Rb1 標(biāo)準(zhǔn)品(批號110704-201122)和陽性藥物利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(批號：140629-200202),購自中國食品藥品檢定研究所[11];Marc-145 細(xì)胞,購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。 PRRSV 由高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征活疫苗(JXAI-R 株,廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司)擴(kuò)增所得,按Reed-Muench 法測得TCID50為10-5.4[12]。

1.3 GSR1 高效液相色譜鑒定 按照《中華人民共和國獸藥典》2015 年版二部GSR1 章節(jié)中高效液相色譜法測定GSR1 含量。 色譜條件如下：色譜柱：Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250 mm,5 μm);柱 溫：30 ℃;紫外檢測波長：203 nm;流動相：色譜純乙腈-超純水(30 ∶70);流速：1 mL/min;進(jìn)樣量：10 μL。GSR1 對照品溶液和供試品溶液的制備：減重法稱取GSR1 單體樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各2 mg,溶于10 mL 甲醇(色譜純)。 根據(jù)出峰時(shí)間判斷是否是同一物質(zhì),按峰面積計(jì)算GSR1 含量。

1.4 GSR1 細(xì)胞毒性和抗PRRSV 作用測定 將GSR1 和利巴韋林分別用細(xì)胞維持液配制為初濃度4 mg/mL 和1 mg/mL 溶液,2 倍倍比稀釋后加入Marc-145 單層細(xì)胞的96 孔培養(yǎng)板上,記錄CPE 情況。 72 h 后,MTT 法測OD 值,分別計(jì)算GSR1 和利巴韋林的CC50和最大安全濃度(MNTC)。 在安全濃度范圍內(nèi)將GSR1 和利巴韋林連續(xù)2 倍倍比稀釋為5 個梯度,分別和100 TCID50的病毒液同時(shí)加到Marc-145 單層細(xì)胞上,另設(shè)細(xì)胞和病毒對照組。 待病毒對照組CPE 達(dá)到80% ～90%,MTT 法測各孔OD 值,計(jì)算GSR1 對病毒的抑制率(IR)。 計(jì)算抑制半數(shù)細(xì)胞感染病毒的藥物濃度(EC50)。 得到GSR1 的選擇指數(shù)SI,SI= CC50/EC50。

1.5 GSR1 對PRRSV 直接滅活作用 將終濃度為最大安全濃度的GSR1 和100 TCID50病毒液1∶1混合在37 ℃培養(yǎng)30、60、90、120 min 和150 min 后,加至Marc-145 單層細(xì)胞的96 孔板上,病毒對照組按相同培養(yǎng)時(shí)間處理,培養(yǎng)至病毒對照組CPE 達(dá)到80% ～90% 時(shí),MTT 法測各孔OD 值,計(jì)算GSR1 對病毒的抑制率。

1.6 GSR1 對PRRSV 復(fù)制的阻斷作用 將100 TCID50病毒液加至單層的Marc-145 細(xì)胞96 孔培養(yǎng)板上,分別培養(yǎng)1、2.5、4、6、8、10、12 h 和14 h。 在每個節(jié)點(diǎn),PBS 沖洗,加入100 μL 濃度為MNTC 的GSR1,培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。 設(shè)置細(xì)胞對照組和病毒對照組,記錄、測定方法同上。

1.7 GSR1 對N 基因作用的測定 單層Marc-145細(xì)胞中加入100 TCID50的病毒孵育4 h 后,PBS 沖洗,加入MNTC 的GSR1,繼續(xù)培養(yǎng)至12、24、36、60、72 h,另設(shè)細(xì)胞對照、陽性藥物對照和病毒對照,提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 利用NCBI 網(wǎng)站引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)PRRSV N 基因特異性引物,上游引物序列：5′-AGAAGCCCCATTTCCCTCTA-3′,下游引物序 列： 5′-CGGATCAGACGCACAGTATG-3′。 普 通PCR 進(jìn)行引物特異性驗(yàn)證,將重組質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,FQ-PCR 測定各組N 基因拷貝數(shù)。

1.8 GSR1 對N 蛋白表達(dá)作用的測定

1.8.1 間接免疫熒光定性檢測N 蛋白表達(dá)變化 將100 TCID50病毒液加至單層的Marc-145 細(xì)胞384孔板上,培養(yǎng)4 h,PBS 沖洗2 遍,加入20 μL MNTC的GSR1,設(shè)細(xì)胞對照、病毒對照、陽性藥物對照。培養(yǎng)48 h 后PBS 清洗,加入冰丙酮：甲醇(1∶1)的固定液10 μL 固定30 min;PBS 清洗,加入抗鼠源N 蛋白抗體(1∶50)孵育3 h;PBS 清洗,加入羊抗鼠IgG/FITC 熒光二抗(1∶20)孵育1 h;PBS 清洗,加入配制的DAPI 染液每孔10 μL,拍照。

1.8.2 Western Blot 定量檢測N 蛋白含量變化 單層Marc-145 細(xì)胞中加入100 TCID50的病毒孵育4 h后,PBS 沖洗,加入MNTC 的GSR1,培養(yǎng)60 h,另設(shè)細(xì)胞對照、陽性藥物對照和病毒對照,利用蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞總蛋白。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,一抗孵育,將抗β-actin 鼠單克隆抗體(1∶1 500)和抗N 蛋白鼠單克隆抗體(1∶1 500)用封閉液稀釋,二抗孵育,將山羊抗鼠IgG(1∶5 000)用TBST 稀釋,孵育結(jié)束膠片曝光,分析蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 GRS1 高效液相色譜鑒定 GSR1 單體樣品和標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 出峰時(shí)間和峰面積結(jié)果見表1、圖1。根據(jù)公式計(jì)算GSR1 含量為97.781%;說明人參皂苷Rb1 樣品純凈且含量高,可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 HPLC 出峰時(shí)間、峰面積數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖1 人參皂苷Rb1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品HPLC 圖譜結(jié)果

2.2 GSR1 細(xì)胞毒性和抗PRRSV 作用測定結(jié)果 根據(jù)CPE 記錄情況和計(jì)算得到的細(xì)胞病變率,由表2 可知,GSR1 的MNTC 大于4 mg/mL,利巴韋林的MNTC 為0.125 mg/mL,GSR1 抗PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞的最高抑制率為88.2%,利巴韋林最高抑制率為61.4%,說明GSR1 在Marc-145 細(xì)胞上的安全范圍更廣,且抗PRRSV 作用更強(qiáng)。 此外,在一定濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加,其抗病毒作用增強(qiáng),表明GSR1 和利巴韋林對PRRSV 的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(見圖2A、B)。

表2 細(xì)胞毒性測定和抗病毒作用試驗(yàn)結(jié)果

圖2 GSR1 和利巴韋林對PRRSV 病毒感染Marc-145 細(xì)胞的抑制作用

圖3 人參皂苷Rb1 對PRRSV 的直接殺滅作用

2.3 GSR1 對PRRSV 直接滅活作用試驗(yàn)結(jié)果 由圖3 可知,GSR1 與病毒共同作用30 min ～150 min 過程中顯示抑制率均高于50%,最高抑制率達(dá)到54.65%,且各時(shí)間點(diǎn)沒有顯著差異(P ＞0.05)。 表明GSR1 可以直接滅活PRRSV,且不呈時(shí)間依賴關(guān)系。

2.4 GSR1 阻斷PRRSV 復(fù)制的試驗(yàn)結(jié)果 由圖4可知,在PRRSV 先感染1 h ～12 h 后再加入GSR1,GSR1 對PRRSV 的抑制率均高于50%,最高抑制率可達(dá)到60.01%。 在PRRSV 感染14 h 時(shí),GSR1 對PRRSV 的抑制率低于50%,且顯著低于PRRSV 感染1 h ～12 h(P ＜0.05)。 在病毒感染2.5 h ～12 h,GSR1 對PRRSV 的抑制率無顯著變化(P ＞0.05)。推測GSR1 在PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞12 h 內(nèi)可有效阻止病毒復(fù)制。

圖4 GSR1 對PRRSV 復(fù)制的阻斷作用

2.5 熒光定量PCR 檢測N 基因含量 FQ-PCR 測定N 基因拷貝數(shù)結(jié)果見圖5。 在病毒感染細(xì)胞12 h 時(shí),與病毒對照組相比,GSR1 試驗(yàn)組N 基因拷貝數(shù)沒有顯著變化。 在病毒感染細(xì)胞的24 h ～72 h,4 mg/mL和2 mg/mL GSR1 組N 基因拷貝數(shù)均顯著低于病毒對照組(P ＜0.05)。 1 mg/mL GSR1 在病毒感染細(xì)胞24、36 h 和72 h 時(shí),可顯著降低N 基因拷貝數(shù)(P ＜0.05)。 利巴韋林組N 基因拷貝數(shù)在試驗(yàn)所測試時(shí)間范圍內(nèi)均顯著低于病毒對照組。 說明GSR1 可以抑制PRRSV N 基因的表達(dá),且呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

2.6 GSR1 對N 蛋白含量的測定結(jié)果 GSR1 對N蛋白含量影響試驗(yàn)中,先感染PRRSV 再加GSR1 培養(yǎng)48 h 后,經(jīng)IFA 結(jié)合DAPI 染色觀察PRRSV 陽性細(xì)胞數(shù)。 中插彩版圖6A 結(jié)果顯示,相對于PRRSV組,各試驗(yàn)組中綠色熒光細(xì)胞數(shù)明顯少于病毒對照組,說明4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL GSR1 和利巴韋林均可很好地抑制病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散和細(xì)胞內(nèi)N 蛋白的表達(dá),且GSR1 減少N 蛋白陽性細(xì)胞的能力隨藥物濃度的降低而減弱,具有劑量依賴性。隨后利用Western Blot 測定細(xì)胞中N 蛋白含量,細(xì)胞上先加病毒4 h 后加入藥物,60 h 后收集細(xì)胞,由中插彩版圖6B 可知4 mg/mL GSR1 和利巴韋林可以較好的抑制N 蛋白的合成,且GSR1 抑制N 蛋白合成的能力隨濃度的降低而減弱。

3 討論

圖5 病毒復(fù)制期間各組N 基因拷貝數(shù)結(jié)果

豬繁殖與呼吸綜合征是由PRRSV 導(dǎo)致的高度接觸性傳染病、免疫抑制性疾病。 現(xiàn)代研究稱中藥提取物具有潛在的抗病毒活性[13],篩選藥用植物中所含有的可能抗病毒成分成為研發(fā)抗PRRSV 藥物的新趨勢。 本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),甘草酸二鉀、丹參酮ⅡA 磺酸鈉具有很好的直接殺滅PRRSV 和阻止病毒復(fù)制的作用[14-15]。 GSR1 是人參的主要成分,具備無毒性、提高機(jī)體免疫作用、作用發(fā)揮不受特定內(nèi)臟器官限定、有恢復(fù)功能的特點(diǎn),是治療病毒性疾病的良好參選藥物[16]。 本試驗(yàn)試圖首次證明GSR1 具有體外抑制PRRSV 感染細(xì)胞的能力,并評價(jià)GSR1 的抗病毒效果以及初探GSR1 的抗病毒機(jī)制。

在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中,GSR1 的最大安全濃度4 mg/mL 大于利巴韋林的0.125 mg/mL。 其次,對PRRSV 抑制作用試驗(yàn)結(jié)果顯示,GSR1 SI ＞11.67,最大抑制率為88.2%。 而SI 數(shù)值大于3 同時(shí)對病毒的抑制率高于50%,是藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究的必要條件。 因此與陽性藥物利巴韋林相比,GSR1 具有較強(qiáng)的抗PRRSV 作用和較寬的安全范圍。 GSR1在直接殺滅PRRSV 試驗(yàn)中,GSR1 與病毒共同作用30 min ～150 min 過程中抑制率均高于50%,且各時(shí)間點(diǎn)沒有顯著差異(P ＞0.05)。 表明GSR1 可在較短時(shí)間內(nèi)直接殺滅PRRSV。 GSR1 在影響PRRSV復(fù)制試驗(yàn)中,前12 h 有持續(xù)抑制作用,最高抑制率達(dá)60%,在PRRSV 感染14 h 時(shí),GSR1 對PRRSV 的抑制率低于50%,且顯著低于PRRSV 感染1 h ～12 h(P ＜0.05)。 推測GSR1 在PRRSV 感染Marc-145 細(xì)胞12 h 內(nèi)可有效阻止病毒復(fù)制。

有報(bào)道稱PRRSV 的核衣殼蛋白在感染的第12小時(shí)可以被檢測到[17],表明PRRSV 在感染12 h 內(nèi)開始合成病毒蛋白,那么GSR1 很可能對病毒核衣殼蛋白的合成有干擾作用。 早有報(bào)道發(fā)現(xiàn),PRRSV核衣殼蛋白N 可識別連接病毒、子代病毒和宿主RNA,識別宿主和病毒蛋白,在感染細(xì)胞核內(nèi)通過某些蛋白結(jié)合綁定至宿主RNA 區(qū)域,干擾宿主細(xì)胞功能,幫助病毒復(fù)制[18]。 也有報(bào)道證實(shí),某些中藥提取物是通過影響病毒蛋白的表達(dá)來起作用,例如小檗堿的衍生物ACV 可以抑制HSV-2 DNA 復(fù)制,是通過影響其中某些蛋白的合成來發(fā)揮抗HSV-2 的作用[18];青蒿酯可以通過阻斷非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒的早期蛋白的表達(dá)來抑制病毒的生長繁殖[19]。 所以我們推測GSR1 對病毒核衣殼蛋白的合成有抑制作用,并設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行證明。 FQ-PCR 試驗(yàn)結(jié)果表明,4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL GSR1 在24 h ～72 h 可以穩(wěn)定有效的降低N 基因的合成,并存在劑量差異。 IFA 試驗(yàn)結(jié)果表明4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL GSR1 和利巴韋林均可很好地抑制病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散和細(xì)胞內(nèi)N 蛋白的表達(dá),隨后利用Western Blot 得出4 mg/mL GSR1 和利巴韋林可以較好的抑制N 蛋白的合成。 兩項(xiàng)結(jié)果一致表明,大劑量GSR1 具有和利巴韋林相似的抗N 蛋白合成能力,不僅可以抑制N 基因的表達(dá),還可抑制N 蛋白的合成。 原因可能是GSR1 抑制合成N 基因生物反應(yīng)鏈上的某個環(huán)節(jié),起到抑制作用。

本文通過使用不同的加藥方式,證明GSR1 可通過直接殺滅PRRSV 和阻止病毒復(fù)制來發(fā)揮其抗病毒作用。 并進(jìn)一步證實(shí)GSR1 可以抑制病毒N 蛋白的表達(dá)。 這些結(jié)果為GSR1 作為抗病毒候選藥物提供理論依據(jù),并為其可能作用靶點(diǎn)提供方向。