3 種組織保存方法在進(jìn)行流式細(xì)胞倍性分析和DNA 含量測定中影響比較研究

茆安婷, 尹玉偉, 代 靜, 郭曦堯, 程 義, 李 東, 李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 吉林 長春130118)

多倍體是具有3 套或更多染色體組的生物體,在植物中最為常見,約95%的蕨類植物和所有的被子植物均為多倍體[1-2]。 近年來,通過對鯽魚的DMRT1 保守基因的分析,發(fā)現(xiàn)其存在額外兩輪的多倍化。 雖然多倍體存在著一些如導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化,造成細(xì)胞減數(shù)分裂困難和表觀遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn),但是一旦其成功適應(yīng)這些變化,可能促進(jìn)生物進(jìn)化成功并豐富物種多樣性[3]。 多倍體在全球分布廣泛,其中寒冷地區(qū)生物頻率高于溫帶地區(qū),說明多倍體更能抵御惡劣的環(huán)境。 簡言之,多倍體的產(chǎn)生為個(gè)體和種群帶來巨大優(yōu)勢,也正是這些優(yōu)勢成為多倍體水產(chǎn)動(dòng)物的優(yōu)良性狀,從而使多倍體成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中一類重要的物種[4-10]。

流式細(xì)胞儀為檢測手段的技術(shù)稱為流式細(xì)胞術(shù),具有檢測速度快、純度高、變異系數(shù)小、可多參數(shù)測量、靈敏度高且操作簡便等特點(diǎn)。 該研究選用低溫凍存組織、乙醇固定組織和活體組織采樣直接檢測3 種方法,運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行花羔紅點(diǎn)鮭DNA 含量和倍性分析的效果進(jìn)行對比,探究不同方法對樣品檢測結(jié)果的影響,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件,減小誤差,便于更好的開展魚類遺傳育種及保護(hù)利用研究。

1 材料與方法

1.1 材料

花羔紅點(diǎn)鮭(Salvelinus malma)采自吉林省白山市森源冷水魚場,暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室9 ℃水中。 EPC細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 樣品制備 低溫凍存組織的采集：花羔紅點(diǎn)鮭經(jīng)乙二醇苯醚麻醉后液氮速凍30 min,后移至-80 ℃保存36 h,于自封袋中蒸餾水解凍,融化后剪取胸鰭裝于干凈的自封袋中,置于冰上備用。

乙醇固定組織的采集：花羔紅點(diǎn)鮭經(jīng)乙二醇苯醚麻醉,剪取胸鰭置于70%乙醇離心管中4 ℃保存36 h 備用。

活體組織采集：花羔紅點(diǎn)鮭經(jīng)乙二醇苯醚麻醉后,剪取胸鰭裝于干凈自封袋中,置于冰上備用。

細(xì)胞染色：將鰭條組織放入平皿后加入1 mL PBS,用兩大小眼科鑷子磨成勻漿狀,200 目篩網(wǎng)過濾到1.5 mL 離心管內(nèi),1 000 r/min 離心15 min。PBS 洗滌兩次,棄去上清液。 加入1 mL 冰浴預(yù)冷的70%乙醇,輕輕吹打混勻,4 ℃固定2 h,之后離心棄去上清液。 加入1 mL 冰浴預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞,再次離心棄去上清液,輕彈離心管分散細(xì)胞。 向每管中依次加入染色緩沖液、碘化丙啶染色液(PI)和RNaseA。 37 ℃避光溫浴30 min。 使用EPC 作為內(nèi)參,染色方法相同。

1.3 細(xì)胞檢測和數(shù)據(jù)分析 染色后的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)進(jìn)行檢測,激光波長488 nm,依據(jù)樣品情況設(shè)置參數(shù)Height-FSC 等。 花羔紅點(diǎn)鮭倍性測定采用EPC 細(xì)胞系作為內(nèi)參,流速控制在每秒150 ～300 個(gè)細(xì)胞,每次檢測10 000 個(gè)細(xì)胞,每個(gè)樣品檢測3 次。 檢測結(jié)果由流式細(xì)胞儀的FlwoJo 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

圖1 EPC(A)、活體組織(B)、70%乙醇固定(C)、低溫凍存組織(D)流式檢測直方圖

圖2 EPC(A)、活體組織(B)、70%乙醇固定(C)、低溫凍存組織(D)流式檢測散點(diǎn)圖

圖3 EPC(A)、活體組織(B)、70%乙醇固定(C)、低溫凍存組織(D)FL2 A-FL2 W 寬度圖

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法保存鰭條組織流式結(jié)果分析 花羔紅點(diǎn)鮭鰭條組織3 種不同保存方法的檢測結(jié)果見圖1,流式檢測直方圖中橫坐標(biāo)代表熒光面積,縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量。 圖1A 為EPC(鯉魚上皮細(xì)胞),由圖像可見明顯單峰,細(xì)胞數(shù)量足且分裂旺盛,周期明顯,二倍體波峰對稱性好,可以作為樣品的可信內(nèi)參。 圖1B 為活體組織細(xì)胞,四倍體波峰處有明顯單峰,波峰左右對稱性好,重復(fù)試驗(yàn)時(shí)結(jié)果穩(wěn)定,表明實(shí)驗(yàn)效果理想。 圖1C 為70%乙醇固定組織細(xì)胞,四倍體處有明顯單峰,但從縱坐標(biāo)來看細(xì)胞數(shù)量相對較少,表明該方法在試驗(yàn)中形成了細(xì)胞碎片導(dǎo)致檢測結(jié)果不理想,重復(fù)試驗(yàn)時(shí)結(jié)果不及活體樣品,但在條件限制的情況下,該方法可作為實(shí)驗(yàn)材料短期保存的手段之一。 圖1D 為凍存組織細(xì)胞,出現(xiàn)細(xì)胞粘連,細(xì)胞數(shù)量少,雜峰較多,從圖中已經(jīng)無法分辨細(xì)胞周期,該方法結(jié)果不理想,不適合作為組織保存方案。 圖3 的FL2A -FL2W 寬度圖中FL2 -A 為熒光峰面積,反映DNA 含量,FL2 -W 代表熒光的脈沖寬度,可以區(qū)分單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞粘連體。 該圖中反映樣品倍性信息,R2 門中富集的細(xì)胞為二倍體,R3 門中富集的細(xì)胞為四倍體,R4 為六倍體,依此規(guī)律類推。 被檢測樣品細(xì)胞富集在R3 中,圈門時(shí)應(yīng)注意去除FL2 -A 相同而脈沖寬度較大的呈梯形分布的細(xì)胞粘連體。

2.2 不同方法保存鰭條組織DNA 含量和倍性分析 以鯉魚上皮細(xì)胞DNA 含量為參比,3 種保存方法后測得DNA 相對含量如圖4 所示,結(jié)果見表1。 3 種保存方法測得的DNA 含量大小為活體組織＜乙醇固定＜低溫凍存。 每種方法均進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)以減小試驗(yàn)誤差。 在3 種被測的樣品中,經(jīng)過低溫保存的樣品出現(xiàn)較多雜峰,表明這種保存方法不能保證細(xì)胞的完整性,在制備細(xì)胞懸液時(shí)破碎的細(xì)胞較多,并形成粘連體,得出結(jié)果可信度不高。

表1 3 種保存方法測得DNA 含量

圖4 EPC(A)、活體組織(B)、70%乙醇固定(C)、低溫凍存組織(D)相對DNA 含量直方圖

2.3 多倍體流式結(jié)果分析 所有檢測樣品中,測得1 例樣品為多倍體(圖5)。 采用活體組織處理的方法,在EPC 作為內(nèi)參的條件下,六體波峰間有較明顯單峰,但由于樣品多次重復(fù)試驗(yàn)細(xì)胞數(shù)量不足。在DNA 含量方面,六倍體個(gè)體比四倍體具有稍多的DNA 含量,猜測在進(jìn)化程度上較四倍體高級。

圖5 六倍體流式細(xì)胞檢測直方圖

3 討論

鮭魚中的染色體數(shù)目存在廣泛變異,基于其基因組大小和染色體臂數(shù)接近二倍體魚類的兩倍,鮭科魚類同源四倍體起源學(xué)說已被提出[11-13]。 隨著基因組復(fù)制或外來基因的整合,包括基因組與原始基因組結(jié)合的諸多生物學(xué)問題,都有待于進(jìn)一步探究重復(fù)的基因在這些水生生物后代中產(chǎn)生的作用?；ǜ峒t點(diǎn)鮭屬我國吉林與黑龍江省特產(chǎn)的冷水魚類,對環(huán)境要求極高。 由于氣候、環(huán)境、人為因素干擾等原因已處于瀕危狀態(tài),被列入《中國東北地區(qū)珍稀瀕危動(dòng)物志》。 除自然產(chǎn)生的多倍體外,也可以考慮人工誘導(dǎo)花羔紅點(diǎn)鮭多倍體以提高抗逆性能,豐富其物種數(shù)量,挽救瀕危物種。

文章通過3 種不同花羔紅點(diǎn)鮭鰭條組織保存方法流式實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),活體采集的新鮮鰭條組織在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)效果最好,在制備單細(xì)胞懸液時(shí)效果理想,細(xì)胞數(shù)量充足,數(shù)據(jù)分析過程中可見明顯峰圖,重復(fù)試驗(yàn)時(shí)結(jié)果穩(wěn)定。 70%乙醇4 ℃短期保存的鰭條組織波峰明顯,最高峰對稱性良好,圖像可見細(xì)胞周期分明,DNA 含量與新鮮組織相比結(jié)果接近,在制備單細(xì)胞懸液時(shí)出現(xiàn)的少量粘連體可以通過設(shè)門進(jìn)行有效剔除,排除其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 低溫凍存鰭條組織的方法不能較好的保證細(xì)胞的完整性,出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片,不能給實(shí)驗(yàn)提供可信結(jié)果。

近年流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的選材多選血液,而鰭條組織在樣品采集過程中簡單易得,制備過程難度較小,所得細(xì)胞數(shù)量充足,楊紅喜等[14]以鰭條組織作為實(shí)驗(yàn)材料能夠作為流式細(xì)胞分析的替代材料并且獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 本研究首次利用流式細(xì)胞技術(shù),探究了花羔紅點(diǎn)鮭在DNA 含量及倍性方面的信息,為開展該物種染色體組工程組學(xué)的研究提供了基礎(chǔ)資料,同時(shí)實(shí)驗(yàn)有待于充實(shí)多倍體生物樣本,深入探究花羔紅點(diǎn)鮭四倍體與多倍體之間生長性能、免疫能力上的差異,更廣泛而確切的揭示基因組和基因變化特征的問題,建立良好的模型支持,為多倍體形成的普遍規(guī)律提供有利數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。